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[求救] primer訂製出錯的可能性？

看板Biotech (生命科學)作者 (豆漿)時間16年前 (2010/05/26 10:54), 編輯推噓8(8推 0噓 14→)
留言22則, 12人參與, 最新討論串1/1
目前ligation遇到了瓶頸，交叉測試之後 認為問題所在可能是primer上RE認的位置及切位 所作的測試如下 兩種RE算過濃度後，各自單獨切vector，成功 => RE及buffer沒問題 被切一刀的vector作ligation，成功 => ligase及ligase buffer沒問題 competent cell使用vector作transformation測試，成功 => competent cell沒問題 現在能想到的可能性，只有在作insert的PCR時，所使用的primer有問題 RE認的位置或切位可能不對，造成RE根本沒切到insert 接下來應該會用TA cloning確認 請問有人碰過跟廠商訂primer時出錯的情況嗎？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.44.46
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05/26 11:22, , 1F
之前有聽過有些廠商 合成primer會出錯
05/26 11:22, 1F
推
05/26 12:48, , 2F
有可能,而且機率不算低
05/26 12:48, 2F
推
05/26 12:56, , 3F
有, 遇過, 明X
05/26 12:56, 3F
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05/26 13:10, , 4F
我就是跟明X訂的...
05/26 13:10, 4F
推
05/26 15:44, , 5F
遇過 我把定序檔給他們看 馬上重合一條給我 可以試看看
05/26 15:44, 5F
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05/26 15:53, , 6F
定序才能知道有沒有錯
05/26 15:53, 6F
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05/26 15:54, , 7F
我對明X 的經驗倒是沒遇過錯
05/26 15:54, 7F
推
05/26 17:46, , 8F
我也是明X...讓我多搞了快1個月 = =
05/26 17:46, 8F
推
05/26 17:58, , 9F
要定序才知道 insert本來就會比較難切 你有切比較久試試看嗎
05/26 17:58, 9F
推
05/26 18:41, , 10F
NEB有提供哪種enzyme需要oligo多幾個mer還有效率
05/26 18:41, 10F
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05/26 18:42, , 11F
incubation的時間長短 所需的Unit
05/26 18:42, 11F
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05/26 20:52, , 12F
我用的是SapI及XhoI, primer在RE位置之前有多設計六個bp
05/26 20:52, 12F
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05/26 20:53, , 13F
也有按照DNA濃度加適量Unit的RE
05/26 20:53, 13F
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05/26 22:39, , 14F
inser切完跑膠看一下有沒有東西吧
05/26 22:39, 14F
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05/26 22:39, , 15F
說錯 是PCR完
05/26 22:39, 15F
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05/26 23:38, , 16F
有 PCR完我會切下正確長度的band作ligation
05/26 23:38, 16F
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05/26 23:46, , 17F
把你的PCR產物作TA cloning 然後再切 或拿去定序
05/26 23:46, 17F
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05/27 01:19, , 18F
嗯 我接下來就是要這樣做
05/27 01:19, 18F
推
05/27 07:28, , 19F
本來就有可能出錯 確定出錯的話就馬上打去叫他們重做
05/27 07:28, 19F
推
05/27 11:46, , 20F
gel extration得到的產物會比較難接進去! 建議直接clean up
05/27 11:46, 20F
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05/27 11:47, , 21F
根據某老闆的說法是 EtBr會影響ligation效率
05/27 11:47, 21F
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06/03 16:16, , 22F
PCR extension時間沒給夠，兩端沒做完也會接不上。
06/03 16:16, 22F
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