[求救] BrdU螢光雙染

看板Biotech (生命科學)作者takkyu (心情真好~)時間16年前 (2010/03/26 10:47)推噓0(0推 0噓 3→)

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各位板友好，我目前在嘗試BrdU螢光雙染，但是一直不是很成功。以下是我的方法，想請各位指點。 SD-rat brain section、厚度8um、free-floating的染色方式。所使用的一抗、二抗分別為： mouse anti-BrdU (Sigma-Aldrich, B2531, 1:250) mouse anti-NeuN (Chemicon, MAB377, 1:500) Hoechst33258 (Vector) Alexa Fluor goat x mouse 488 & 594 (Invitrogen, 1:500) 染色步驟如下： 1. PBSTx2, PBSx1 各五分鐘 2. 3% H2O2 in PBS 20分鐘 --> PBSx2 各十分鐘 3. 10% NGS + 1% TritonX-100 + 1% BSA + PBS blocking 1hr 4. 1st Ab + 2% NGS + 0.2% TritonX-100 + PBS 4度 overnight 5. PBSx2 各五分鐘 6. 2nd Ab + 2% NGS + 0,2% TritonX-100 + PBS 2hr 7. PBSx2 --> Hoechst33258 10分鐘 --> PBSx2 8. 8% paraformaldehyde 15分鐘 --> PBSTx2, PBSx1各五分鐘 9. 2N HCl in PBS 45度 30分鐘 --> 0.1M borate bufferx2 各十分鐘 10. 5% NGS + diluent (1% BSA + 0.5% Tween20 + 0.1% sodium azide + PBS) 37度 15分鐘 11. BrdU 1st Ab + diluent 37度兩小時 12. PBSx2, 各五分鐘 --> 撈片 --> anti-fade ps. 8% paraformaldehyde的方法主要參考這篇文章 Journal of Neuroscience Methods 115 (2002) 97-105 BrdU的染色方法則照Sigma-Aldrich所提供的datasheet 目前的結果往往是NeuN有signal但其他兩者沒有或者是NeuN和Hoechst沒有signal，而BrdU的signal亦很微弱，想請教各位改善的方式，謝謝板友~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 120.126.97.10