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[求救] methylation specific PCR的條件怎麼抓？

看板Biotech (生命科學)作者 ( )時間16年前 (2010/04/16 15:46), 編輯推噓3(3推 0噓 18→)
留言21則, 5人參與, 最新討論串1/1
不知道板上有沒有人也在做epigenetics方面的實驗。 尤其在MSP的部分，似乎PCR的條件不比一般。 有一些primer設計出來後跑個一兩次就有結果，但有些則是一直卡住。 想問問做這方面相關的大大們，都怎麼去抓條件呢？ 如何才是最有效率也省成本的做法呢？ 另外在bisulfite modification的部分，大家都是用kit嗎？ kit又是哪家廠牌型號的呢？ 非常感謝有經驗的人可以給點建議！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.25.156
推
04/16 16:23, , 1F
你用自己的sample去抓條件嗎?? 還是有positive ctrl?
04/16 16:23, 1F
推
04/16 16:24, , 2F
我們家是用EZ DNA Methylation-Gold™ Kit
04/16 16:24, 2F
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04/16 22:14, , 3F
喔~對了!忘了問大家positive ctrl是用?
04/16 22:14, 3F
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04/16 22:15, , 4F
我知道廠商也有賣universal的，但每個condition
04/16 22:15, 4F
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04/16 22:15, , 5F
應該都不太一樣吧~目前是自己的sample抓不太到條件。
04/16 22:15, 5F
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04/16 22:23, , 6F
可以問問進階 我目前是用他們家一組universal methylated
04/16 22:23, 6F
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04/16 22:23, , 7F
當作 positive 但是我突然忘了是哪家的
04/16 22:23, 7F
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04/16 22:33, , 8F
嗯 那大家自己的sample是怎麼去抓條件比較快呢?
04/16 22:33, 8F
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04/16 22:43, , 9F
你是指PCR的condition嗎？我會先做個gradient來抓Tm 還有我E
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04/16 22:45, , 10F
EZ的kit的protocol有建議的PCR condition 其實你應該要先確定
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04/16 22:46, , 11F
你的sample 要找的gene 有methylation吧？不然怎麼跑都跑不出
04/16 22:46, 11F
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04/16 22:47, , 12F
這個基因是新的基因，只是推測可能會有甲基化
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04/16 22:48, , 13F
gradient我試過 不知道d大的梯度是怎麼去設呢?
04/16 22:48, 13F
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04/16 22:54, , 14F
建議你可以先用positive跑Tm-10~Tm+10（不知道我有回答到你
04/16 22:54, 14F
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04/16 22:54, , 15F
另外若是沒有methylation 那unmethylation primer
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04/16 22:54, , 16F
就應該要P得出來 所以主要問題應該還是條件
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04/16 22:56, , 17F
原則上是這樣 但是我覺得MSP Primer設計也有關係因為是GCrich
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04/16 22:58, , 18F
所以本來就不太好P 很多時候是無論Meth or Unmeth都沒有
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04/17 20:41, , 19F
感謝大家的建議和指導~
04/17 20:41, 19F
推
04/21 11:31, , 20F
經過我多年經驗 直接換一組 或是template下重一點
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04/21 11:32, , 21F
bisulfite 這種處理很奇怪
04/21 11:32, 21F
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