[閒聊] CNM compartmental protein extraction …

看板Biotech (生命科學)作者eyest (李察狄恩安德森)時間16年前 (2010/04/16 17:03)推噓3(3推 0噓 0→)

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不知道在版上可不可以分享kit的實驗流程若不行請告知一聲，我會刪除的會想要分享這篇主要是因為看步驟兩個小時左右就可以搞定的東西，卻花掉我半天的時間，真的很抓狂，尤其是其中一個步驟很搞剛，用掉超多時間的... 以上閒話講完了，進入這套kit的說明吧~ 這套kit是用於分離細胞或是組織的細胞質,核及膜的技術，比起傳統的方式，一般平均需要兩天的工程吧，相對於這套kit方便多了，時間也省下不少呢。這邊我是使用皮膚角質層細胞HacaT 細胞，也許是因為這種細胞的特性特別堅強，害我要打破細胞花掉1.5小時真的很無奈... 這組kit有限制細胞，最高可以使用2*10的7次方細胞數，最低可以使用2.5*106細胞，因為在步驟裡已經標示好最高細胞數所需要的buffer量，所以我第一次先使用 4*106細胞數，方便換算說明書裡面需要用的量。我是種在6 well裡面medium去除，PBS洗兩次，加 trypsin-EDTA，切下細胞，收集到小tube裡，室溫,2000rpm,5min 去除trypsin-EDTA，加入kit的buffer C 400ul (額外加入ki附的 protein inhibitors cocktail 3.18ul)，4C，搖20分鐘 2. 接著使用針頭孔徑26.5~30的針打破細胞，在這邊我是用孔徑30，1CC包裝的針打破細胞，讓細胞質出來，在這邊說明書上提到說大約來回沖打細胞50~90次左右，就可以使細胞破裂至95% 原本還在想說要這麼多次，手部就酸死了，一開始還很有耐心的數沖打幾次，半小時過去了，我也懶的數了，取幾滴放到6 well的蓋子上拿到顯微鏡下面觀察，這些細胞也太健壯了吧，每顆細胞都完好如初是我對你們太溫柔了吧...接下來我就決定將細胞抽起來在大力的衝到tube裡，兩三次後，tube裡面的泡泡變多，再放慢速度沖打這樣來回半小時後，心想這樣沒問題了吧，在取一些到顯微鏡下面觀察確實跟上一次看到的細胞數比較有比較少了，但還是有很多細胞很強壯，就是不破，是因為皮膚細胞特別堅強嗎?只好再繼續沖打的動作...持續了1.5小時，再次觀察，終於阿，我可以離開沖打細胞的窘境裡了，在顯微鏡下看，細胞數量已經寥寥無幾了，照理說應該要在多打幾下的，但是我已經在這個步驟花掉太多時間了，決定往下個步驟走，4C,13000rpm,20min，保留上清液(這就是我要的細胞質阿) 3. 清洗一下pellet，取kit的 buffer W 800ul(加protein inhibitor 6.36ul) 在4C,搖5min，接著4C,13000rpm,20min，丟掉上清液 4. 加入 buffer N 200ul (加protein inhibitor 1.59ul)，在4C,搖5min 接著4C,13000rpm,20min保留上清液(收集到第二個細胞核啦~) 5. 直接加入buffer M 200ul (加protein inhibitor 1.59ul)在 4C搖5min，接著4C,13000rpm,20min保留上清液(連細胞膜的部分也到手了) 6. 接著就是測濃度~原本想說每一管的量至少都有200ul可以用很多次沒問題吧，測出來卻發現細胞質濃度高>細胞核>細胞膜... 假設細胞質的濃度是1ug/ul，細胞核就是0.5ug/ul 細胞膜更慘，只有0.3ug/ul左右，也太低了吧，這樣我跑western 是要load多少阿...跟老闆說明這情形之後，老闆說其實測細胞質核膜濃度不用到非常高，不然就是細胞質和核都用15ug，細胞膜用10ug 跑一次western，壓不同抗體看看有沒有分離乾淨，下次再做實驗的時候可以把buffer的量都減少，這樣濃度就會提高了。我也是這樣想的，所以以上的步驟流程是我第一次做的量，第二次再抽細胞質核膜我就會把抽細胞核和膜的體積都減少，細胞質(buffer C)加 400ul 細胞核(buffer N)加 100ul 細胞膜(buffer M)加 50ul 這樣濃度應該就可以提升了吧~哈哈，等我在做一次再看看吧，但是我不是很想再碰這個實驗了耶...再抽打細胞那個步驟花掉我超多時間的，連中餐都是請同事幫我買回來的，真的很麻煩... 以上的閒聊加分享到此告一段落啦，若是不能po這種文章請告知我會盡快刪除，謝謝大家耐心的看完我的文章阿... 寫文章都沒有做實驗累了，雖然說比這個實驗更複雜的實驗一大堆但是就是想上來抒發一下~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.20.153.102