[求救] 抽cell line genomic DNA

看板Biotech (生命科學)作者sunnyforever ( )時間16年前 (2010/05/17 18:45)推噓1(1推 0噓 5→)

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我用的是傳統phenol:chloroform:IAA的方法。步驟大致如下， 1.將dish裡medium倒掉，加入PBS wash兩次， 2.直接加入lysis buffer到dish，將cell輕輕刮下收到eppendorf 3.incubate at 52度 for 4hr, 4.加入等量PCI，invert 10分鐘,離心25分鐘 5.吸上清液再加入等量chloroform 離心20min 6.加sodium acetate 等倍isopropanol -20 overnight 7.離心25分鐘 RT 8.吸棄上清液用70% ethanol wash 兩次每次3~5分鐘離心20分鐘 9.RT晾乾, ddH2O回溶放55度數小時冰-20 依上述實驗步驟只過一次PCI依然會殘留很多蛋白，老師說lysis buffer裡面 proteinaseK量下重一點 incubate久一點可是後來我這樣做以後gDNA跑膠卻smear, 再過一次PCI 或是 chloroform也是會有smear的情形再抽的過程DNA也會像鼻涕一樣黏稠每次離心或是回溶都很不好溶過PCI後要吸上清液也是很難吸會牽帶一些蛋白上來酒精wash也會放段時間或是多洗幾次才會沉澱想請問 1.proteinaseK的量或是incubate的時間會使DNA斷裂嗎 2.多過幾次PCI或是chloroform會造成DNA斷裂嗎 3.離心的時間太久或是酒精wash時間和次數會影響嗎 4.回溶要怎麼回溶DNA才會溶得好呢 5.另外再鹽類沉澱的步驟後用tip撈會比較乾淨嗎? 另外我問其他抽過的人她們說以前抽Cell line的gDNA並沒有像我抽到這樣黏稠狀請有經驗的大大可以指導一下~感謝~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.25.156 ※ 編輯: sunnyforever 來自: 140.116.25.156 (05/17 19:00)