PTT職涯區 / Biotech (生命科學)

[求救] His-tag protein 純化問題

看板Biotech (生命科學)作者 (火球連發~)時間15年前 (2010/07/16 08:12), 編輯推噓6(6推 0噓 23→)
留言29則, 7人參與, 最新討論串1/1
目前我使用His-BIND Resin來純化我的蛋白質 使用的plasmid為pPICZaC使我的目標蛋白尾巴帶有6xHis 我使用的是約15ml管住(內填充3ml resin約1cm高) 試劑為 8X Binding Buffer(40mM imidazole,4M NaCl,160mM Tris-HCl pH 7.9) 8X Washing Buffer (480mM imidazole, 4M NaCl, 160mM Tris-HCl pH 7.9) 4X Eluting Buffer (4M imidazole, 2M NaCl, 80 mM Tris-HCl pH 7.9) 4X Striping Buffer (400mM EDTA, 2M NaCl, 80 mM Tris-HCl pH 7.9) 8X Charging Buffer (400mM NiSO2) 步驟如下 (1) 使用3ml ddH2O清洗三次 (2) 5 ml之1X Charging Buffer清洗三次 (3) 3 ml之1X Binding Buffer清洗兩次 SAMPLE使用8X Binding Buffer調成1X 純化步驟如下： (1)將酵素的crude extract加於column上端(有濃縮過約10ML粗抽濃縮成2ML)。 (2)以20 ml之1X Binding Buffer沖洗column。 (3)以18 ml之1X Washing Buffer沖洗column。 (4)以7 ml之1X Eluting Buffer沖洗出結合於resin上之酵素，並收集沖洗出之純化酵素 溶液。 (5)最後以6 ml之1× Striping Buffer清洗column，藉以移除resin上之Ni2＋，並將 column (含1x Striping Buffer)存放於4℃冰箱以備下次純化時使用。 然後使用PBS pH7.4去透析(約500ml體積) O/N移除IMIDAZOLE 接著使用SDS-PAGE分析並沒有看到純化的BAND產生 酵素活性測試發現從crude extract加入column後活性最高 接著binding buffer washing buffer eluting buffer都檢測的到活性 且越來越低 這是沒有接上his嗎? 或者是imidazole濃度太高了? 我膠體這次是第二次跑是新的，以前沒跑過，步驟有錯誤嗎麻煩大家指點! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.35.106 ※ 編輯: relaxsleep 來自: 140.129.35.106 (07/16 08:13) ※ 編輯: relaxsleep 來自: 140.129.35.106 (07/16 08:14)
推
07/16 09:55, , 1F
有先小量induction確定有表現嘛?
07/16 09:55, 1F
推
07/16 10:24, , 2F
他的crude extrzct都有band了...wash 60mM是一般範圍
07/16 10:24, 2F
→
07/16 10:24, , 3F
不過你的binding buffer就留不住蛋白了 有定序過
07/16 10:24, 3F
→
07/16 10:25, , 4F
his有in frame?
07/16 10:25, 4F
→
07/16 10:43, , 5F
小量有很明顯的一條band 大量表現後雜band就變多了
07/16 10:43, 5F
→
07/16 11:32, , 6F
序列到HIS-都是對的是IN FRAME
07/16 11:32, 6F
→
07/16 16:02, , 7F
有用antiHis確認過有沒有表現嗎?
07/16 16:02, 7F
→
07/16 17:04, , 8F
我沒用antihis耶 目前把eluting的都拿去濃縮7ml→0.2ml
07/16 17:04, 8F
→
07/16 17:05, , 9F
有看到淡淡的band這是抓到的濃度太低嗎@@?
07/16 17:05, 9F
→
07/16 18:55, , 10F
你染色的方式是?
07/16 18:55, 10F
→
07/16 18:56, , 11F
有可能是protein上的his跟Ni結合力太低
07/16 18:56, 11F
→
07/16 18:58, , 12F
可以試試看加入少量的detergent glycerol
07/16 18:58, 12F
推
07/16 19:21, , 13F
單用his-tag要抓到很純的蛋白 大概命要很好(遠望)
07/16 19:21, 13F
→
07/16 23:44, , 14F
我使用Coomassie Blue R250染色 DETERGENT GLYCEROL加
07/16 23:44, 14F
→
07/16 23:45, , 15F
的濃度是?? 在哪步驟加呢?
07/16 23:45, 15F
→
07/16 23:45, , 16F
blue大說的好心酸阿XD
07/16 23:45, 16F
推
07/19 09:17, , 17F
友情推..你有那各命嗎~XD"
07/19 09:17, 17F
推
07/22 13:10, , 18F
pPICZaC.你應該是使用pichia表現收外泌蛋白吧
07/22 13:10, 18F
→
07/22 13:12, , 19F
感覺protein結合力太低...可能要檢查一下charging的藥劑
07/22 13:12, 19F
→
07/22 13:12, , 20F
還有濃縮的步驟蛋白是否lost掉..或沉澱...
07/22 13:12, 20F
→
07/22 13:14, , 21F
我是用Qiagen的 ni-nta agarose 不必charging
07/22 13:14, 21F
→
07/22 13:14, , 22F
但步驟建議binding的步驟是使用buffer懸浮agarose
07/22 13:14, 22F
→
07/22 13:16, , 23F
將agarose與蛋白溶液混合 搖晃2hr~隔夜 抓更多的his-
07/22 13:16, 23F
→
07/22 13:17, , 24F
可能比直接將蛋白液通colunm抓得更完全吧
07/22 13:17, 24F
→
07/22 13:18, , 25F
外泌的蛋白比胞內單純的多 得到純的蛋白機會應該是好一點
07/22 13:18, 25F
→
07/22 13:19, , 26F
可以說明怎麼濃縮嗎?
07/22 13:19, 26F
→
07/23 01:34, , 27F
我有懸浮起來binding 濃縮是使用膜離心那裝置 忘了叫啥
07/23 01:34, 27F
→
07/23 01:36, , 28F
分子量是10KDA的膜 比他分子量小的會濾過去 水也是
07/23 01:36, 28F
推
08/07 04:54, , 29F
會不會plasmid序列有錯沒做出his tag阿....?
08/07 04:54, 29F
‣ 更多 relaxsleep 的文章
文章代碼(AID): #1CFwGBnA (Biotech)
Biotech 近期熱門文章
更多 近期熱門文章 >>
PTT職涯區 即時熱門文章
更多 即時熱門文章 >>
‣ 更多 relaxsleep 的文章
文章代碼(AID): #1CFwGBnA (Biotech)