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[討論] 有關E.coli是否會踢掉plasmid的問題

看板Biotech (生命科學)作者 (文昌帝君)時間15年前 (2010/08/13 21:51), 編輯推噓2(2推 0噓 15→)
留言17則, 7人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
版上各位朋友 小弟最近正在做cloning ，正好做到從LB/Amp plate中挑選colony 做 PCR 確定是否有DNA insert。 我的方式是用10 ul的 tip 點菌接種到 20ul 的 LB中，在37度中培養一小時後 取1ul菌液做PCR，計畫再將確定有夾出片段的菌落取至LB/Amp中養大抽plasmid。 菌在LB only中37度培養一小時後,放在四度冰箱一天 後來我的同事告訴我這可能會導致E.coli將plasmid踢掉，因為環境失去了 Amp選擇的壓力；後來我又補了50ug/ml的Amp使其在四度中放置兩天 請問大家，這樣處理的菌如果真能在2ml LB/Amp中長起來(取1ul菌液在2ml LB/Amp養)， 會不會抽不到plasmid? -- 所有技術上的努力都要由關心人類和其命運出發 為了讓人類心智的創造物有益而不是有害 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 111.82.118.201
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08/13 22:25, , 1F
我不清楚這樣會不會踢掉 我都是抽小量 用enzyme來確認的
08/13 22:25, 1F
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08/13 22:27, , 2F
而我的作法是 養菌完後 馬上離心 除LB上清液後 丟-20度冰箱
08/13 22:27, 2F
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08/13 22:28, , 3F
目前是都抽的出來！！也沒踢掉的問題！
08/13 22:28, 3F
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08/13 22:30, , 4F
小量：6ml LB + 100 μg/ml Amp (會保留1ml作菌種)
08/13 22:30, 4F
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08/14 01:10, , 5F
當E.coli繼續複製之後~子代的plasmid會快速的降低
08/14 01:10, 5F
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08/14 01:11, , 6F
而原本的E.coli應該不會lose掉plasmid~!
08/14 01:11, 6F
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08/14 13:21, , 7F
踢掉plasmid的細菌不就長不起來了嗎,長得起來就只剩有的
08/14 13:21, 7F
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08/15 00:22, , 8F
良心建議:做實驗還是一口氣做完比較好。放來放去的實驗
08/15 00:22, 8F
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08/15 00:23, , 9F
品質難以控制。萬一實驗失敗了，要追蹤也不好追。
08/15 00:23, 9F
推
08/15 01:15, , 10F
我的作法是，colony+10ul LB+Ap，直接colony PCR（取1ul）
08/15 01:15, 10F
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08/15 01:16, , 11F
接著再加1ml的LB+Ap，養隔夜...隔天應該就知道哪個要哪個不
08/15 01:16, 11F
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08/15 01:16, , 12F
要了吧
08/15 01:16, 12F
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08/15 01:17, , 13F
所以我一開始就放在1.5ml epp.裡面～我覺得還蠻方便的
08/15 01:17, 13F
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08/15 01:23, , 14F
感謝各位! 星期一抽的結果會跟大家報告的
08/15 01:23, 14F
推
08/15 02:21, , 15F
直接用滅菌牙籤點菌後,先沾到Amp plate,再沾到PCRtube
08/15 02:21, 15F
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08/15 02:22, , 16F
做colony PCR,然後就可以拿到PCR結果和有號碼的plate
08/15 02:22, 16F
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08/15 02:23, , 17F
Amp只是抑制菌的生長,不會殺死菌,所以放久會有雜菌
08/15 02:23, 17F
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