Re: [求救] 抽大量plasmid,isopropanol沈澱後看不 …

看板Biotech (生命科學)作者 (情人去死)時間15年前 (2010/09/29 22:01), 編輯推噓7(7012)
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再次求救,偶爾有抽到,但是最近又開始抽不到了,唉。 我抽midi,一樣follow qiagen midi protocol, 只是我菌養超多,500ml,分兩支column, 中間有照它的建議,保留一些sample下來, 今天最後又抽失敗了,還特別跟別人借了一組midi column和全部的buffer, 在他們實驗室確定是能正常working的, 因為我家的buffer也不知道放多久了, 但最後發現, 1. 我第一次wash的部份就有plasmid (收400ul isopropanol沈澱) 2. 但我elution的部份沒看到,(收100ul,isopropanol沈澱) 我最後isopropanol的沈澱也沒看到 根據,protocol上的說法, 第一次wash有,可能是我養過多的關係, 但是,我的elution又沒有, 能不能幫我想想可能的問題在哪或者我該怎樣做呢? 過多的菌液,應該不會連最後的elution都沒有吧? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.40.60

09/29 22:04, , 1F
因為之前有陣子抽不出來,是搖300ml的菌卻分成兩支column,so
09/29 22:04, 1F

09/29 22:05, , 2F
現在都故意養超多,反正頂多只是流掉,但希望能把column充分
09/29 22:05, 2F

09/29 22:05, , 3F
使用
09/29 22:05, 3F

09/29 22:49, , 4F
加isopropanol後凍在-80 o/n再離心
09/29 22:49, 4F

09/29 23:59, , 5F
有試過,看不見白白的pellet,是代表沒有嗎?
09/29 23:59, 5F

09/30 11:28, , 6F
照你的描述應該是kit有問題 整個kit退回去換新的
09/30 11:28, 6F

09/30 13:45, , 7F
第一,你的菌太多,菌太多Lysis不完全,影響產量.
09/30 13:45, 7F

09/30 14:02, , 8F
第二,wash buffer可能放太久了,換掉~ 不然用75%酒精wash
09/30 14:02, 8F

09/30 14:03, , 9F
第三,elution buffer可以加熱,增加質體溶解度
09/30 14:03, 9F

09/30 14:06, , 10F
最後問一下,你怎麼判定有沒有plasmid,你有測濃度嗎?
09/30 14:06, 10F

09/30 20:34, , 11F
菌太多~就是正解
09/30 20:34, 11F

10/03 02:42, , 12F
midi抽不到大多是菌太多 Lysis buffer用多點+作用久
10/03 02:42, 12F

10/03 02:42, , 13F
一點
10/03 02:42, 13F

10/07 11:35, , 14F
請問你Isopropanol加多少?之前遇過同樣問題!!
10/07 11:35, 14F

10/07 11:36, , 15F
後來調高iso的量,就成功了!這是小弟個人淺見!!
10/07 11:36, 15F

10/08 01:36, , 16F
如果buffer123加完離心後通column, 滴出來的液體有plasmid
10/08 01:36, 16F

10/08 01:36, , 17F
表示菌太多 or column壞了(一般而言還不太可能壞)
10/08 01:36, 17F

10/08 01:37, , 18F
若只有wash時才有東西, 可能是EtOH濃度不夠了吧
10/08 01:37, 18F

10/08 01:37, , 19F
可以根據quiagen的手冊配新的即可
10/08 01:37, 19F
文章代碼(AID): #1CeqR8uq (Biotech)
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