Re: [求救] buffy coat的分離

看板Biotech (生命科學)作者evergreen215 (evergreen)時間15年前 (2010/10/14 23:05)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《Feting ( ><>J <>< し<><)》之銘言： : 小弟是理工背景實驗室的同學 : 最近需要使用白血球進行實驗 : 加了heparin的血液，用3000rpm、4度c、離心15分鐘(沒有使用ficoll) : 之後可以看出血液的分層 : 但是卻不知道要如何將buffy coat從血液中抽出來 : 其實我也不是很確定我以為是buffy coat的東西到底是不是buffy coat : 應該是離心後中間那層很薄的灰白色層吧? : 想請問各位前輩有甚麼方法可以將buffy coat給分離出來 : 另外，buffy coat分離出來是甚麼樣的狀態? : 是液體，還是一片膠狀的東西? : 因為看到某處的操作說明說buffy coat如果夠堅固的話，可以將整片buffy coat挑起 : 由於實驗室的學長姐也沒使用過白血球做實驗，對這些實在不清楚 : 希望各位前輩可以給予指教 : 謝謝你需要白血球做什麼實驗?進一步來說不同實驗需求有不同的做法 (以人血為例) 要抽gDNA: heparinized blood > 2,500xg for 10min at 4℃ > 抽掉plasma > 抽buffy coat (需要技巧,簡單說就是用開口較大的tip慢慢沿邊緣吸起,很難避免吸到RBC; 可進一步加入RBC lysis buffer去除RBC) or 將下層含RBC與buffy coat全部以3倍以上體積的RBC lysis buffer處理 lyse完RBC後500xg for 2min > pellet(WBC)抽gDNA 取PBMC要culture: 已移除plasma的blood+等倍體積的BSS,mix well > 疊在Ficoll-Paque Plus上 > 400xg for 30-40min at 18-20℃ > 取PBMC層(比buffy coat好取很多) > BSS or PBS wash to remove Ficoll (60-100xg for 10min at 18-20℃) 分層完的RBC上頭會有一層灰白色的顆粒球,也可再利用RBC lysis buffer分離出來 Buffy Coat是很雜亂的一大群細胞, 有時候人體處於某些症狀時該層會非常大,也會比較好取 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 122.100.76.231 ※ 編輯: evergreen215 來自: 59.120.7.115 (10/17 12:11)