[求救] PCR問題,無法得到目標產物

看板Biotech (生命科學)作者kingtiger (~（⊙ｏ⊙）~)時間15年前 (2010/11/03 11:17)推噓2(2推 0噓 4→)

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我目前進行的是cell cDNA 的PCR 有兩個目標基因,741bp和608bp 分別由NCBI上兩者的mRNA sequence進行primer的設計 PCR的酵素為advantage PCR 條件如下: 10X buffer 2.5 ul 10uM primer 1 1ul 10uM primer 2 1ul 2.5mM dNTP 2ul cDNA 0.5ul enzyme 0.5ul ddH2O 17.5ul 95C 1mins 95C 30sec 68C 3mins 35cycle 68C 3mins 4C --- 或是 95C 1mins 95C 30sec 54C 30sec 68C 2mins30sec 35 cycle 4C --- 主要的問題是我都有P到東西,但是切下後做gel clear ,TA clonig 並以T7 sp6 primer做PCR check都是對的size 但是sequence之後結果都不是我要的基因利用Blast確認過我的primer都可以辨識到我的目標基因也重新設計過primer取不同區域做目前在試pfu但是就得不到我要的片段大小我的primer有兩種設計一種是有cutting site的,長度25mer 另一種是沒有cutting site的長度約為20個mer 想請問我現在必須再重新設計primer會比較好? 還是PCR條件有什麼方法可以改進因為一直有P到東西但是又都是錯的,很耗時間是否有辦法再送sequence之前能確認? 有cutting site的PCR product我也試著切酵素了,有切出來對的大小,但sequence還是錯麻煩各位先進了我也換過不同的cDNA了,結果還是差不多..... 另外也請有用過e-PCR的人教我怎麼用...看了半天玩不出來 -- . ′人生五十一睡夢 .＊ * ◢ ◢◣︿◢◣ . ＊* 一期榮華一杯酒 *′. ◤◣ ◤︺◥ ◢ ▁▁ ◤◣μ◢◥ - 上杉謙信(1530~1578) - ※ ◣◢︸◣◢◤◣ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.40.29 ※ 編輯: kingtiger 來自: 140.109.40.29 (11/03 16:51)