[求救] M15 competent cell protein induce

看板Biotech (生命科學)作者diffa2 (Zero)時間15年前 (2011/03/08 14:00)推噓3(3推 0噓 8→)

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想請問是否有人使用過M15/[pREP4]來誘導protein的表現，目前在實驗上遇到一些問題想請教大家。在clone上，設計一組primer帶有BamHI cutting site 將基因的CDS (含有start codon 不含 stop codon)將其接入 pQE-60的BamHI site之後trnasformation到M15[pREP4]細菌中表現。 plasmid的架構: ------------CC ATG GGA GGATCC ATG-------------------TAA---- vector上的 start codon BamHI CDS的start codon vector上的stop codon transformation到M15/[pREP4] competent cell中塗盤到含有Kanamcyin(25μM) 及 Ampicillin(50μM)的LB plate，挑single colony到養菌管含有Kan(25μM) 和Amp(50μ M)的3ml LB中，搖16小時候取500μl的菌液，以1:100的菌量放大加到含有Kan(25μM)和 Amp (50μM)的50ml的LB中，置37℃incubator 3 hr後用IPTG induce 3~4 hr (37℃)，最後跑膠的結果都沒有induce出來。之後分別用了不同濃度的IPTG indce (0.005mM~100mM) 也都沒有induce出protein。之後也將M15/[pREP4] competent cell分別劃菌在含有Kan(25μM ) 和Amp(50μM)的 plate中，在amp的LB-plate菌沒有長可是在Kan的LB-plate中有長，接著將Kan plate中的 single colony到含有Kan(25μM)的3ml LB中搖16小時抽菌的plasmid，pREP4 plasmid大小3740 bp但我抽出來的plasmid supercoil form跑膠大小在9 Kb的位置，但在Kan plate 中會長colony但抽出的plasmid大小有不同，不知問題出在哪裡。想請問是否有人有用M15/[pREP4]誘導過protein，請教各位了><”。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.115.48.76