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[求救] Ligation一直失敗~

看板Biotech (生命科學)作者 (期待雨後的彩虹)時間15年前 (2011/04/09 18:33), 編輯推噓5(5推 0噓 6→)
留言11則, 5人參與, 最新討論串1/3 (看更多)
大家好,目前在進行ligation碰到了問題, 請大家幫幫忙 我目前要接的insert約1.6k,而vector是8.4k左右 insert是先用PCR放大(在primer各加BamHl以及Xhol的切位), 接TA clone, TA clone sequence結果正確, insert與多加的限制?切位也都有, 之後將insert與vector加入BamH1與Xhol切, 37度, 2.5~3小時~ 跑膠結果大小都正確~ 經過gel elute之後insert濃度約94ng/micro liter 而vector濃度約18ng/micro liter V:I condition= 1:5, 因此ligation體積是V:I=1 microliter:5 microliter, total volume是10 microliter, ligation buffer是10X的, Ligation用兩種方式進行: 在16度裡overnight(a)與4度overnight(b) transform也用兩種方式: 放冰上15min直接塗盤(c) 塗盤之前加入SOC medium, 37度, 1hr後塗盤(d) 因此有a-c,a-d,b-c, b-d四個plate, 但今天結果是一個colony都沒長~ 想請教各專家, 我會是在哪個步驟出問題呢? 謝謝各位專家~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 114.39.99.16
推
04/09 19:01, , 1F
ligation如果沒問題的話，可能是轉形～size有點大可能不好送
04/09 19:01, 1F
推
04/09 20:56, , 2F
沒有做heat-shock?comptent cell有做positive control嗎?
04/09 20:56, 2F
→
04/09 21:43, , 3F
雖然一開始很懷疑,但我還是先按照產品說明書
04/09 21:43, 3F
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04/09 21:44, , 4F
不做heat shock,但我應該要同時做positive control的
04/09 21:44, 4F
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04/09 21:45, , 5F
謝謝milkpa專家的提醒~
04/09 21:45, 5F
推
04/13 08:27, , 6F
我現在也是做ligation一直失敗:((
04/13 08:27, 6F
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04/13 08:29, , 7F
想順便問問大家 在ligation前都用機器直接測DNA濃度嗎?
04/13 08:29, 7F
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04/13 08:30, , 8F
我是用跑膠去測vector和insert的亮度比
04/13 08:30, 8F
推
04/13 12:36, , 9F
我比較懶，我憑感覺...insert給爆多，vector一點點
04/13 12:36, 9F
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04/13 12:37, , 10F
不過我insert大都比vector短
04/13 12:37, 10F
推
04/19 03:44, , 11F
insert都給比vector還要很多的量 大約1比5至6左右
04/19 03:44, 11F
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