[求救] EGF stimulation

看板Biotech (生命科學)作者 (resistor)時間15年前 (2011/05/01 01:08), 編輯推噓0(0011)
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請問有人用EGF刺激H1299或其他肺癌細胞嗎? 實驗中要用EGF刺激下游的AKT.ERK表現 想要間接證明細胞膜上的EGFR受藥物影響 但control組本身AKT.ERK的表現量很高 導致加入EGF後看不出差異 參考文獻後發現 每篇control的EGFR.AKT.ERK的表現量差異很大 有的幾乎沒表現 有的刺激前後沒太大差異 表現量都蠻高的 paper對加EGF的部份並沒有很詳細的描述 所以想請教大家 加入EGF前需要把medium換成serum free 還是直接加入就好 細胞數對EGF刺激的結果是否有影響 因為要處理藥物加上要收western用的sample 所以種的細胞數很多 3x10^6/10 cm dish 就EGFR.pEGFR的部份 抽膜蛋白結果是否會更準確? paper上似乎都沒有提到這點 請有經驗的高手提供我一些意見了 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 118.167.168.48

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通常都會starvation, 因為FBS裡也很多growth factor會影響.
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lysis buffer中有detergent(SDS)的話通常都可以收到膜蛋白
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不過我沒試過沒加的.
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AKT建議看phosphorylation,量不一定準
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另外在乳癌的研究文獻上,看AKT前似乎都會做starvation
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我對receptor不熟,但是我們實驗室的其他人玩estrogen
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receptor用millipore的RIPA有不錯的結果,不然膜蛋白可以
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用sonication來輔助抽取.
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此外如果你想證明"膜上"這種localization,建議用confocal
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請問一般starvation的時間大概多久?
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我的經驗是overnight(12-16h)先試, 然後看細胞狀況調整.
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文章代碼(AID): #1Dl48CD2 (Biotech)
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