Re: [求救] 請問冷凍切片螢光染色的小黃點..

看板Biotech (生命科學)作者mikis1107 (mikis1107)時間15年前 (2011/05/11 13:34)推噓2(2推 0噓 6→)

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※ 引述《twcitizen (Sterco-Cephaly)》之銘言： : ※ 引述《mikis1107 (mikis1107)》之銘言： : : 我想請問冷凍切片的免疫螢光染色結果 : : sample組上面出現的小黃點是甚麼東西 : : 有方法可以避免嗎? : 我有做過組織免疫染色以及相關hybrdization實驗 : 不過之事很久沒有更新，請指教 : 第一點 : back-round noise (white noise) : 對於white noise，增加signal是個不錯的方法 : 但是減少noise也很重要 : S/N比會上升 : : 去OCT : : lysotracker 50 nM, 37度, 40 min : 既然是免疫染色，使用lysotracker(?是一種probe?)要做什麼？喔喔這是lysosme的maker : : PBS wash : : 4% paraformaldehyde固定 RT 10 min : 既然是冷凍切片，為何還要用固定過程？ : 多一項過程就會多很多項變數因為我看on line protocol也都是有fix的步驟可能是因為要固定內部蛋白表現 : : wash : : 1% BSA RT 50 min : : wash : BSA或許不錯，有試過其他的blocking agent? 目前正在試二級抗體的serum 一般用5% 要試的條件5%跟10% goat-serum 根據abcm onlne protocol 有說用paraformaldelyte固定的section 可能會產生許多free aldehyde group 造成高度的background 可以在blocking buffer中加入0.3M 的 glycine與之結合降低背景值或是換成aceton來block 這我試過但是染出來的效果會有螢光不均勻的現象目前兩者也在試驗階段 : : 一級抗體 in 1% BSA 4度 O/N : : wash : : 二級抗體(488) in 1% BSA 37度 15 min : : wash : : Hochest 1:4000 RT 15 min : : wash, mounting : : 有詢問過學姊 : : 因為rat heat是自己取的有洗的比較乾淨 : : 而sample是請別人取的 : : 說可能是紅血球沒有清洗乾淨的關係@@ : 這要看你的一級與二級AB針對的是什麼 : AB絕對不可能100％只針對target tissue抓上去 : 你去問學姐不如問教授，或者拿AB的data sheet來研究 : 上網去查這些AB有哪些人用過？他們的M＆M？ : 他們的結果與可能的noise在哪裡？ : 去問別人之前，自己做點功課會比較好 : : 學姊有建議我可以用biotin放大目標蛋白的訊號 : : 就是一級抗體+二級抗體接biotin+三級抗體接biotin : : (應該是這樣吧@@) : 假設 S = 5, N = 3 : 你使用增強的S = 7，但是別忘了noise是出自哪裡？ : 如果跟你的M＆M直接相關（例如1st, 2nd Ab) : 那麼你的N也會增強，就比如N = 4 : 前S/N = 5/3 = 1.67 : 後S/N = 7/4 = 1.75 : 是有比較好，但是沒有好多少，noise的問題你不知道，就還是在那裡 : 只是就以前的經驗分享，當然請各位高手指正感謝您的分享就我目前手邊在try的條件會先試過在上來問人感恩^_____^ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 223.143.78.37