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[方法] blunt-end ligation 的 protocol

看板Biotech (生命科學)作者 (..)時間15年前 (2011/05/20 21:16), 編輯推噓5(5推 0噓 5→)
留言10則, 6人參與, 最新討論串1/1
最近在做 blunt-end ligation 不過不知道到底哪裡出了問題 總是接不起來 不然就是長了 colony 後，去RE digest check 都是怪怪的 size 所以想來這邊詢問有沒有人有做過 blunt-end ligation的經驗 可以和我說一下須要注意的地方 和實驗的步驟流程呢 謝謝 1. DNA vector 11.9 kb insert 2.2 kb 2. DNA vector 11.9kb insert 2 kb 因為我是 subcloning 的關係所以我先將 insert 和 vector 分別用兩組 re double digest，接著 gel extraction ~> ciap treat (37度，30 MIN) ~> add Klenow fragment (TAKARA) ~> 10:1 ligation (16 度C， overnight) ~> transformation 大概流程是這樣，還需要什麼資訊我再補充~謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.79.51
推
05/20 21:34, , 1F
我覺得你最好把你DNA長怎樣、用哪些藥品、怎麼做都列出來
05/20 21:34, 1F
※ 編輯: mgh225 來自: 140.112.79.51 (05/20 21:41)
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05/20 21:35, , 2F
版友才有辦法幫你偵錯...ligation可能發生的問題太多了
05/20 21:35, 2F
推
05/20 21:37, , 3F
最簡單的建議：每一個步驟都做一個positive control
05/20 21:37, 3F
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05/20 21:38, , 4F
確認你那個步驟的條件、藥品有沒有問題
05/20 21:38, 4F
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05/20 21:42, , 5F
我想我可能需要一個正確的protocol
05/20 21:42, 5F
推
05/21 00:38, , 6F
跟一般的ligation一樣啊
05/21 00:38, 6F
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05/21 13:10, , 7F
有試過其他比例嗎？1:4 or 1:6
05/21 13:10, 7F
推
05/21 23:04, , 8F
blunt end不好接 最好別用CIP 除非你只用一刀
05/21 23:04, 8F
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05/22 00:06, , 9F
一刀兩刀都是blunt end阿...
05/22 00:06, 9F
推
05/22 10:14, , 10F
喔 我以為是一端blunt 一端sticky 兩端都blunt我沒做過...
05/22 10:14, 10F
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