[討論] E. coli表現的EGFP在激發後是否可以直接用肉眼觀察到？

看板Biotech (生命科學)作者akongapple (Mr. Kang)時間14年前 (2011/08/09 00:27)推噓3(3推 0噓 2→)

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在版上爬文有爬到幾篇有關E. coli是否可以表現recombinant EGFP的討論看來各位專家基本上都認為是可以，不過好像還沒有人分享實際經驗所以在此提出我的實驗想請教大家一些問題以我的實驗來說，我實驗的目的是要在一段protein A的C-ter.接上EGFP後treat cancer cell line來觀察cancer cells uptake的狀況，但我目前還在純化protein 的階段，之前已經construct出我要的recombinant protein A-EGFP fusion plasmid，我知道如果要大量表現蛋白用E. coli BL21會比較好但是現在我將這個recombinant plasmid送進E. coli DH5alpha後，想說先來試試看在induction後是否會產生螢光，我的做法有兩種，第一是將DH5alpha養在含有Ampicillin和IPTG的LB agar plate上養overnight後用藍光或紫外光激發看是否會有綠色螢光產生第二是將DH5alpha養在含有Ampicillin和IPTG的LB medium養overnight後一樣用藍光或紫外光激發看是否會有綠色螢光產生結果是看不太出來有綠色的螢光產生但是我有用螢光顯微鏡將E. coli塗在載玻片上後觀察用藍光激發後發現會有微弱的綠色螢光存在，但是真的很微弱，要用暗視野曝光20秒才拍得到後來我用sonicator將菌打破後收集上清液，理論上應該可以觀察到上清液發出綠色螢光，因為會有native form的protein A-EGFP存在上清液中結果是一樣看不出綠色螢光這邊想請教大家是否有這方面的經驗可以分享，是否會因為我前面接一段protein A 而影響到EGFP的beta barrel結構導致無法正確folding產生螢光不過在上課時老師有提到不管EGFP N-ter.或C-ter.接上什麼蛋白，基本上都會發光還是用DH5alpha表現的蛋白有比較大的機率被protease分解，所以EGFP表現的量不足以用肉眼觀察以上，請教大家，謝謝了。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 114.36.145.156