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[求救] 抽plasmid之後的sample確認 我的電泳爆 …

看板Biotech (生命科學)作者 (Drabbit)時間14年前 (2011/09/19 17:09), 編輯推噓12(12推 0噓 10→)
留言22則, 15人參與, 最新討論串1/1
大家好 初次在板上發文 請海含 小妹所學不多 想請各位高手給些意見 以下就直接切入重點了 小妹最近抽了兩次的plasmid要送做定序用 步驟大致上如下： 首先先將sample做DNA純化(有二次電泳確認UV下沒有切到雜訊) 然後Ligation 接著Transformation 等藍白篩結果出來後 選取白色的菌落至50 ml falcon tube培養 然後隔天跟著kit上的步驟抽plasmid 最後一步是加 50 ul Elution buffer 存放在-20度C 為了確認sample是否是我們要的 會再做第三次的電泳確認 問題就在這了!!!!! 我的膠圖像是被附身一樣 以下是我最後跑膠的condution和圖片： 第一次 gel:1% 內染:EtBr 1 ul(小片膠) 電泳:95 V/35 min loading dye:3 ul sample:5 ul marker:3 ul http://ppt.cc/XF2x 結果像是跑出了一堆彗星 不過送定序後到沒有什麼問題 第二次 gel:2% (我猜測跟膠濃度有關 因此改為2%) 內染:EtBr 2 ul(大片膠) 電泳:95 V/35 min loading dye:3 ul sample:3 ul (推測可能是上次sample加太多 因此減少) marker:3 ul http://ppt.cc/Um@S 這次反而跑出像有雜訊的樣子 http://ppt.cc/6XtQ http://ppt.cc/,vZX 可是切膠後的確認確定是沒有切到雜訊的 問題1: 為什麼拖尾巴的情形會這麼嚴重 (一般電泳都不會有這種情形 唯有抽plasmid後的確認才出現) 問題二: 第二次的圖要怎麼解釋比較好 像雜訊的band是雜訊嗎 謝謝大家幫忙解答 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 120.107.166.175
推
09/19 17:37, , 1F
看起來有點濃稠。阿為什麼是提高膠體濃度？不是應該減少？
09/19 17:37, 1F
→
09/19 17:57, , 2F
從"mini用50ml tube"培養,就可以推測整個問題是plasmid太濃
09/19 17:57, 2F
推
09/19 18:07, , 3F
mini抽出來濃度至少都有300 ng/ul以上吧 你加了3ul...
09/19 18:07, 3F
→
09/19 18:08, , 4F
應該是你加了太多DNA才會拖尾這麼嚴重
09/19 18:08, 4F
→
09/19 18:09, , 5F
你看看旁邊的marker，最亮的也才100~150 ng左右而已
09/19 18:09, 5F
推
09/19 19:23, , 6F
= = overload 實驗室沒人告訴你嗎?
09/19 19:23, 6F
推
09/19 21:24, , 7F
跑gel前DNA都不先測一下濃度嘛!?大概100ng就夠了
09/19 21:24, 7F
→
09/19 21:26, , 8F
另外check plasmid不切成線狀跑~size怎麼會對?!
09/19 21:26, 8F
推
09/19 22:56, , 9F
circular和supercoil form的差別啊~不是雜訊
09/19 22:56, 9F
推
09/19 23:47, , 10F
同上 看起來就是太濃而已
09/19 23:47, 10F
推
09/20 00:19, , 11F
plasmid濃度太濃而已....
09/20 00:19, 11F
→
09/20 00:20, , 12F
overload 另外uncut plasmid不應跑2% gel,0.8%~1%較適合
09/20 00:20, 12F
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09/20 01:46, , 13F
1.overload, 2.plasmid不切，跑出什麼鬼都有可能
09/20 01:46, 13F
推
09/20 02:27, , 14F
plasmid太濃
09/20 02:27, 14F
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09/20 09:10, , 15F
1.DNA下太濃 2.沒有digest這種現象正常
09/20 09:10, 15F
推
09/20 11:00, , 16F
鞭得好兇XD 然後dye加太多有可能跑錯喔
09/20 11:00, 16F
推
09/20 11:55, , 17F
check的時候下1ul就夠,第一次的gel沒做好
09/20 11:55, 17F
謝謝大家的意見!! DNA和plasmid的測量方式和濃度有經過老師是OK的 我有問他CHECK加3 ul會不會太多 不過老師覺得保險起見 也因為只是要作粗略的測試，所以才沒有測濃度和切成線狀! 感謝K大的解答 我有請問老師了 老師也是這樣說明!! 第一次gel因為臨時改濃度，所以當天配，放得不夠久>< 謝謝大家寶貴的意見!!!! ※ 編輯: Drabbit 來自: 120.107.166.175 (09/20 12:56)
推
09/20 21:26, , 18F
有時候不要太相信老師的話，畢竟大多數老師離第一線實驗
09/20 21:26, 18F
→
09/20 21:26, , 19F
工作已經有段時間了，問同樣在做實驗的學長姊比較好
09/20 21:26, 19F
推
09/24 05:37, , 20F
1.load太多 2.plasmid二級結構
09/24 05:37, 20F
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09/24 05:39, , 21F
另外你列出的條件都只有體積沒有濃度 這樣並不是很嚴謹..
09/24 05:39, 21F
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09/24 05:40, , 22F
建議你做實驗都以"濃度"為準則 可以避免很多不必要的麻煩
09/24 05:40, 22F
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