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[求救] long pcr p不出來

看板Biotech (生命科學)作者 (sylvia)時間14年前 (2012/03/24 15:32), 編輯推噓5(5推 0噓 9→)
留言14則, 7人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
目標是15k的genomic dna 使用了好幾種方法都P不出來 Polymerase是kapa的long range hotstart pcr 號稱最多可P到20k 我的做法: 一開始怎麼P都是smear，懷疑是primer太短(20 bp)_ 後來改成28~30 bp的primer去p 一開始夾不到東西，後來降低annealing溫度(TM-10度) 還有加上普通的TAG(TOP TEN)以1:1,16:1去P 夾的到東西但都是10K以下 有加上NESTED方法去P但都是SMEAR 做法是根據PROTOCAL 94度C 3分 94 25秒 tm-10 15秒 68 15分 共10 cycle 94 25秒 tm-5 15秒 68 15分加上每cycle增加20秒 共25cycle 72度c 15分 請問我該怎麼調整呢 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.29.210
推
03/24 18:00, , 1F
genomic DNA濃度也有影響~可以稀釋看看
03/24 18:00, 1F
推
03/24 19:42, , 2F
annealing加長有時候會有用
03/24 19:42, 2F
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03/24 21:50, , 3F
我的dna濃度只有20~70 ng，這樣還需要稀釋嗎？
03/24 21:50, 3F
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03/24 21:50, , 4F
另外爬文有看到增加denature的時間，請問這樣有用嗎
03/24 21:50, 4F
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03/25 02:30, , 5F
你的Tm值是幾度阿，會smear有可能是primer專一性不夠
03/25 02:30, 5F
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03/25 02:32, , 6F
若這是要用在construct上，只能加長primer提高Tm值
03/25 02:32, 6F
推
03/25 10:18, , 7F
可以試試看提高denature溫度 98度之類的
03/25 10:18, 7F
推
03/25 13:57, , 8F
還是你要分兩段夾...
03/25 13:57, 8F
推
03/27 11:45, , 9F
genomics這個濃度可能還太高 kapa不是有說明書?
03/27 11:45, 9F
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03/27 11:45, , 10F
看看上面怎麼寫 PCR煩就煩在一定要做出來才知條件...
03/27 11:45, 10F
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03/27 21:17, , 11F
tm 55 P不到後改50又p到太多～所以目前用53,54度
03/27 21:17, 11F
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03/27 21:18, , 12F
kapa上面沒有特別說，但我有去看他的example濃度差
03/27 21:18, 12F
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03/27 21:19, , 13F
不多說～目前有提高denature時間但不敢提高溫度怕酵
03/27 21:19, 13F
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03/27 21:19, , 14F
素失效～
03/27 21:19, 14F
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