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[討論] sonication會破壞細胞核嗎?

看板Biotech (生命科學)作者 (edger)時間12年前 (2012/05/26 21:38), 編輯推噓8(8推 0噓 57→)
留言65則, 6人參與, 最新討論串1/1
大家好: 目前在抽293T細胞的蛋白質,要將其分為核蛋白,細胞質蛋白及膜蛋白 我是將細胞懸在浮低張溶液並以dounce homogenizer將細胞打破, 然後低速離心.不過有個問題就是細胞無法破的很完全,因此低速離心後 會和細胞核一起沉澱.所以我想用sonication的方式讓plasma membrane 破裂,但不確定對細胞核有無影響. 我的想法是plasma membrane既然都能被sonication破壞, 細胞核應該 也會受到破壞. 希望聽聽各位的意見 麻煩了 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 122.120.132.179
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05/26 22:36, , 1F
我一直以為sonication的重點是震斷黏黏的DNA..
05/26 22:36, 1F
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05/26 22:39, , 2F
要分各區的蛋白, 可以試Thermo的 NE-PER那系列的
05/26 22:39, 2F
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05/26 22:56, , 3F
不能用detergent嗎?
05/26 22:56, 3F
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05/26 22:57, , 4F
sonicator大多可以調強度, 強一點絕對可以打破核膜
05/26 22:57, 4F
推
05/26 23:03, , 5F
不用這樣硬幹吧ˊ_>ˋ 用NP-40就好了
05/26 23:03, 5F
推
05/26 23:05, , 6F
sonication完才看得到核蛋白....
05/26 23:05, 6F
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05/26 23:05, , 7F
破細胞來講 通常sonication就是拿來破核啦
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05/26 23:06, , 8F
你去下載NE-PER的protocol 裡面CERI用你的hypotonic
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05/26 23:07, , 9F
CERII用10% NP-40 NER用high salt buffer 照他流程
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05/26 23:08, , 10F
走就可以拿到小體積的分離(I+II完後洗一下pellet可以
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05/26 23:09, , 11F
降低NE pellet中cyto的殘餘量, 洗完換到新管可以更
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05/26 23:10, , 12F
乾淨) 不建議用sonication是因為拿到核通常是像鼻涕
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05/26 23:11, , 13F
一樣黏成一團 超音波對這種分不開的效率不好ˊ_>ˋ
05/26 23:11, 13F
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05/27 08:13, , 14F
謝謝各位,不過我可能沒有表達很好,其實我的重點是要破plasma
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05/27 08:14, , 15F
membrane,而不希望把細胞核打破,所以想問說哪種方法可以
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05/27 08:15, , 16F
完全的將細胞打破,卻又不會破壞核膜....謝謝各位
05/27 08:15, 16F
推
05/27 08:38, , 17F
原來我打的是外星文一.一
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05/27 09:52, , 18F
哈囉 我有上網看了一下NE-PER的nuclear及cytoplasmic protocol
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05/27 09:53, , 19F
如果CERII是10% NP40(detergent),那麼再這一步核膜就已經破掉
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05/27 09:55, , 20F
這個時候再去離心核蛋白還是留在supernatant,並沒有分離效果
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05/27 09:57, , 21F
所以我想問的是你是不是把CERII和NER兩個搞反了
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05/27 09:57, , 22F
無論如何 還是謝謝你的回答
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推
05/27 10:13, , 23F
NP40是破細胞膜的....照他體積下去稀釋最終濃度0.1％
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05/27 10:13, , 24F
直接加10%當然會破...
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推
05/27 10:16, , 25F
http://ppt.cc/XbVL 還是我看的是不同份的protocol?
05/27 10:16, 25F
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05/27 10:17, , 26F
step3-8完全都是收cyto部分 step9-12才是NE
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05/27 10:31, , 27F
哈囉 我們看的是同一個protocol沒錯
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05/27 10:34, , 28F
不過11ul,10%的NP40加到210ul CERI,最後的濃度是0.52 %
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05/27 10:43, , 29F
如果照你的推論加NP40不會破的話,那加NER(high salt burrer)
05/27 10:43, 29F
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05/27 10:44, , 30F
就更不會破了,也就是照這個protocol走下去,最後凍在-80freezer
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05/27 10:44, , 31F
會是沒有破掉的核
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05/27 10:59, , 32F
另外CERI如果是hypotonic buffer是合理的,因為細胞膜會破
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05/27 11:00, , 33F
就是靠著低張容液將細胞膜撐破,而細胞核有核孔,所以就不會破掉
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05/27 11:01, , 34F
一般的protocol都是加完低張溶液,然後1000g離心將核沉澱
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05/27 11:04, , 35F
一般很少會在離心之前加detergent因為濃度低還是可能會破核
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05/27 11:07, , 36F
我個人覺得如果CERII是high salt buffer,NER若是NP40
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05/27 11:08, , 37F
那最後凍在-80 freezer會是核蛋白,而不會只是沒有破掉的核
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05/27 11:09, , 38F
最後還是謝謝你提供這個方法,看起來很棒
05/27 11:09, 38F
推
05/27 11:36, , 39F
NER使用是高鹽份溶液抽出核蛋白 並不是打破核膜方式
05/27 11:36, 39F
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05/27 11:38, , 40F
高鹽抽出核蛋白原理Google一下就有 另外核膜有蛋白質
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05/27 11:39, , 41F
包覆所以NP40並不會破壞核膜 使用detergent方式破壞
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05/27 11:40, , 42F
細胞膜是因為低張溶液只是讓細胞膜稱大到一個極限
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05/27 11:41, , 43F
要真正破壞就要破壞CHOLESTEROL對細胞膜的穩定性
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05/27 11:41, , 44F
所以才用detergent插入細胞膜達成破壞穩定性效果
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05/27 11:42, , 45F
不使用detergent就用物理性破壞例如針頭的高低壓差
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05/27 11:43, , 46F
還有dounce下去作物理性破壞才可以lysis完全
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05/27 11:45, , 47F
BTW NP40的上限是1％ and我很確定CERII是NP40
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05/28 07:46, , 48F
一般高鹽抽出核蛋白的方式都是在已經打破核膜的情況下
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05/28 07:50, , 49F
在高鹽的情況下,DNA會沉澱,蛋白質會溶在上清液,藉此分離
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05/28 07:51, , 50F
所以有沒有另一種可能,就是加CERII(NP40)後,核膜破掉了
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05/28 07:52, , 51F
但lamin還維持核的結構(membrane包覆著lamin)
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05/28 07:53, , 52F
最後離心後藉高鹽將DNA及proteins分開.
05/28 07:53, 52F
推
05/28 09:25, , 53F
要不要乾脆我附DATA算了?一翻兩瞪眼?
05/28 09:25, 53F
推
05/28 12:25, , 54F
樓上呀..你已經給他魚竿了..他想吃魚就得自己釣囉 @w@a
05/28 12:25, 54F
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05/28 22:33, , 55F
不過討論嘛,不需要這麼激動,感謝
05/28 22:33, 55F
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05/28 22:55, , 56F
我說的另一種可能,就是你講的那樣,CERII是NP40,NER是高鹽溶液
05/28 22:55, 56F
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05/28 22:56, , 57F
我純粹對原理感興趣罷了....
05/28 22:56, 57F
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05/28 22:59, , 58F
順帶一提,發表在Science signaling的一篇
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05/28 22:59, , 59F
DOI: 10.1126/scisignal.2002373,裡面提到這個kit
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05/28 23:01, , 60F
NE-PER,在核的部份其實會雜到membane protein的markers
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05/28 23:05, , 61F
上面沒有講清楚,是plasma membrane proteins
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05/29 01:54, , 62F
其實市面上的kit多少都還是會分不乾淨的......
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05/29 01:54, , 63F
T大其實已經說的很清楚~連原理都附給你了~真的= =
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05/29 08:45, , 64F
我從頭到尾都很感謝有人願意回答這個問題 謝謝
05/29 08:45, 64F
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05/29 09:00, , 65F
這個討論串其實讓我學到不少
05/29 09:00, 65F
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