[求救] caspase colorimetric assay 做不出來
目前實驗在測定從細胞萃出之蛋白的caspase的活性
有從兩方面進行實驗
一個是作western bloting 另一則是利用比色法
但主要還是利用colorimetric來測定
實驗步驟如下:
細胞用不同濃度的藥物作用同樣時間後
1. 利用kit所附之lysis buffer破細胞 取上清液
2. 測定蛋白濃度,用Q水調整至一樣的濃度(100-200ug)
3. 加入reaction buffer
4. 加入substrate
5. 37度作用 2hr
6. 測-405nm
測出來的數據 常會中間的某一個濃度 測出的OD值會突然掉下去
整個很沒趨勢性
想問問 會導致沒有趨勢性的原因可能有哪些?
我自己有想到幾個問題
1. 蛋白濃度測定不準 但跑SDS-PAGE 看actin量並無明顯差異...
2. 因蛋白液有黏性 導致實際加下去作用的體積有誤差?
3. Substrate本身需避光儲存 所以在實驗時96well plate需避光?
4. 混合液體時間過長(因會同時進行2-3組的細胞)
5. 調整蛋白濃度時 使用kit附的dilution buffer有利作用?
6. .....?
落落長的文章~
這實驗實在讓我很困擾呀 阿kit又很貴 看到數據出來心都涼了...
請有經驗的高手們幫幫忙囉
感謝啦
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◆ From: 125.224.10.215
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