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[求救] western ECL反應條件

看板Biotech (生命科學)作者 (Chia)時間13年前 (2013/01/21 22:38), 編輯推噓6(6推 0噓 25→)
留言31則, 8人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
有關western最後一步以冷光呈色劑ECL反應，我們家得做法是： 洗好2抗的膜會放在已剪開得自黏式塑膠膜上， 然後以p1000 pipetman吸取3ml得ECL試劑來回均勻淋在膜上， 最後把塑膠膜蓋上，反應2~5分鐘後，將ECL試劑擦拭乾淨， 再使用冷光照相系統(UVP)偵測。 ~問題來了~ 老師每次看到結果圖都會嫌棄我們是不是ECL沒有淋均勻= = 操作給老師看之後，老師說我淋太快了這樣不行。 因此第二次照着老師建議得速度做了一次，覺得還是很難控制> < 結果還是會有某一區塊比較暗的情形，好像那一塊淋到得ECL比較少的樣子 我們家使用得ECL試劑是millipore的2合1那種。 我想請問大家ECL也是用淋得嗎?有什麼訣竅可以做好這一步? 不然辛苦鑄膠跑膠轉印完hybrid完抗體， 結果敗在最後一步實在很扼腕也很打擊信心呀T T 另外就是我有看過別的實驗室做法， 是像搖抗體那樣，把膜放在ECL裡面搖(反應)。 我想問問版上是否有人也是這樣子做得呢?想要參考看看這樣做該如何抓條件！ 謝謝各位耐心看完我打得東西。 雖然WESTERN實驗變異很多，但因為這一步一直被老師complain， 我又超無解得，實在很苦惱。 有搜尋過版上western相關文章，但發現大家討論照不出東西比較多， 還有跑膠轉印條件之類得..... 最後希望大家實驗都能夠順利啦！謝謝各位^^ ————————————做個分格線———————————— 圖片檔案網址在這邊，如果看不到請再和我說，謝謝各位(感恩) http://ppt.cc/BT4h ◆ From: 219.84.253.154
推
01/21 22:42, , 1F
你可以先將A,B液混合(使用前), 膜先放在面紙吸到無水漬,
01/21 22:42, 1F
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01/21 22:43, , 2F
再將膜移到乾淨的容器或保鮮膜上, 淋上ECL, 將膜完全蓋滿,
01/21 22:43, 2F
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01/21 22:46, , 3F
反應時間後, 可以再準備放到面紙上吸乾到無水漬,就封到膠膜
01/21 22:46, 3F
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01/21 22:48, , 4F
上述流程,已經好久沒用.現在都是直接在容器內呈色就去照相.
01/21 22:48, 4F
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01/21 23:51, , 5F
3ml,這至少可以覆蓋8X6membrane好幾倍,你的很大張?millipor
01/21 23:51, 5F
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01/21 23:52, , 6F
那一套反應時間應該1min就很夠了,反應太久容易燒掉反白
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01/21 23:54, , 7F
沒圖,如果你的多餘ECL水滯有吸掉,說不定是2抗造成訊號不均
01/21 23:54, 7F
推
01/22 01:23, , 8F
用搖的 8x6 cm 應該只要A+B 1~1.5 mL就搖得起來
01/22 01:23, 8F
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01/22 01:24, , 9F
這步我們通常用手搖 約3min左右
01/22 01:24, 9F
推
01/22 08:54, , 10F
拿個小盤子先把膜擺好後盤子斜個角度淋上去
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01/22 08:55, , 11F
在吸取聚到盤子一角的ECL重複淋 要讓ECL均勻流過
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01/22 08:58, , 12F
時間控制在30s-1min 之後把膜夾起來舔擦手紙 正反
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01/22 08:59, , 13F
面都舔 保持濕潤但不要有流動的形狀就好
01/22 08:59, 13F
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01/22 09:01, , 14F
而且M牌反應速度很快很強 泡到5分鐘都反應完了吧..
01/22 09:01, 14F
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01/22 18:48, , 15F
to:blence 我使用的膜是9.5x5大小得。你說沒圖是指實驗結
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01/22 18:48, , 16F
果圖嗎?
01/22 18:48, 16F
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01/22 18:52, , 17F
我們在做的時候真的有反應5分鐘耶~主要會去調整曝光時間
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除非真得太強，就會知道ECL不能反應那麼久。這樣抓條件得
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01/22 23:21, , 19F
可以附個圖嗎?
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01/23 12:09, , 20F
請問用搖的時候是放在小盒子裡面搖還是封口袋之類的東西?
01/23 12:09, 20F
※ 編輯: domoto01 來自: 140.136.181.22 (01/23 12:29)
推
01/23 15:47, , 21F
PCR盒的蓋子很好用.
01/23 15:47, 21F
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01/24 10:58, , 22F
昨天學妹試做了，她用10ml重複使用，反應時間都是5min，
01/24 10:58, 22F
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01/24 10:58, , 23F
照第三張的時候就已經有點弱了。和老師講的時候，他說ECL
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01/24 10:59, , 24F
不要重複使用呀...今天下午meeting老師說要來討論ECL怎麼
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01/24 11:05, , 25F
這一步驟怎麼做來減少實驗誤差= =
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推
01/27 02:12, , 26F
沒重複使用過耶，A+B 大概1.5 ml用手搖+1
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01/28 15:02, , 27F
我的膜是9.5*5，1.5ml量好少膜根本淹不過，這樣搖會反應
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01/28 15:03, , 28F
均勻嗎?請問shin大的膜大小是?
01/28 15:03, 28F
推
01/29 17:04, , 29F
我也用這款 基本上沾一下就可以去照了
01/29 17:04, 29F
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01/29 17:05, , 30F
怕乾掉就在多滴幾滴在上面 最好是可以讓膜上一直有
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01/29 17:05, , 31F
ECL試劑
01/29 17:05, 31F
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