[求救] plaque assay

看板Biotech (生命科學)作者ennnnno (伊諾)時間13年前 (2013/01/08 16:48)推噓3(3推 0噓 6→)

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最近做plaque assay遇到很大的問題每次加完病毒液後細胞都會飄浮=__= 有的well會有的不會,我好難控制他!為什麼為什麼呢??? protocol如下: 1. seeding RD cell 4*105/ml到 6 well plate, 於5% CO2,37℃下培養24hr 2. 將病毒液稀釋至10-1~10-8。 3. 移除6well中的上清液後,加入稀釋好的病毒液,一個well加400μl 4. 加入病毒液後,每15min 用手搖晃一次,使病毒液均勻分佈,1hr 5. 加入2ml含methyl cellulose的DMEM medium 6. 37℃培養3~4 day 7. 觀察有plaque形成後,去除上清液,加10% formaldehyde (2ml/well) 8. 室溫放30min,去除上清液 9. 加1% crystal violet,室溫放30min 10.ddH2O wash,air dry,計數 Methyl cellulose DMEM: 2x DMEM中含4%的P/S和4%FBS,再和1%的Methyl cellulose以1:1混合想要請問的問題有: 1.病毒要dilute至medium中時,medium需要先warm好嗎? 2.我都是很小心的將病毒液從well的邊邊加進去的,一開始加進去沒事,等一會再看, 就會有細胞飄起來,然後實驗就失敗了,我是不是哪裡沒做好呢?而且細胞飄起來的地方並不是我加入病毒液的地方,所以應該也不是我沖的太大力而導致飄起 3.要加入含methyl cellulose的DMEM時,病毒液要吸起來嗎? 4.plaque的形成點要怎麼抓??是看到有一點plaque形成就ok嗎? 謝謝` -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.94.249

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leoblack

01/08 17:04, , 1^F

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jabari

01/08 17:56, , 2^F

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jabari

01/08 17:57, , 3^F

01/08 17:57, 3^F

細胞是21代的,繼代方式是指?就是用trypsin處理後會加medium,然後離心取一點細胞maintain,細胞我是拿別人家做plaque assay ok的細胞可是都找不出原因,為什麼別人家都做的起來但我做不好@@ 也去別人的實驗室看過操作,其實都差不多啊所以才想說上版詢問有沒有奇怪的解決之道還是有更多需要注意的