[求救] 請幫忙解決關於組織萃核蛋白問題

看板Biotech (生命科學)作者emilyliu (微笑下的真實)時間12年前 (2013/05/03 15:32)推噓0(0推 0噓 5→)

留言5則, 4人參與討論串1/1

最近的實驗要萃動物組織(坐骨神經)的核蛋白跑EMSA，幾次萃下來分別拿收得的cytosolic 和 nuclear protein先去跑western，但兩者不管是在b-tubulin 還是PCNA都有壓出的band且都很明顯，表示我萃核蛋白的方法可能有問題，我不是用市面上kit去萃的，上網查過很多關於萃核蛋白的protocol和自己的對照其實方法原理幾乎大同小異，也不確定相同的方法對於萃細胞核蛋白和組織核蛋白理論上應該都是行得通的吧？可是就是無法萃得可以分的很清楚的核蛋白和質蛋白。以下是我使用的protocol 想請有經驗的板友指點在哪個步驟上可能有問題需要修改，一直萃不出核蛋白實驗無法繼續進行實在很困擾阿QQ 1 組織是長度約1 cm 的大鼠坐骨神經，在PBS rinse 過一次後加入540ul 的cell lyisis buffer (10mM HEPES, 10mM KCl, 1.5mM MgCl2,5mM DTT,5mM PMSF)用小剪將組織盡量剪碎至無顆粒，冰上反應30 min 2 加入5％的NP40(我是用cell lysis buffer dilute的)，和前一步驟加入的cell lysis buffer 按照1:9的比例，故取50ul加入。強力震盪1分30秒關於這裡我發現似乎大家使用的NP40濃度都不太相同，從0.5%~10%都有，另也有使用Triton ，不曉得不同濃度比例對於萃取的效果是否有很大的差別？ 3 12000rpm 4度C 1min ，收上清液(cytosolic protein)後再加入 cell lysis buffer 600ul ,震盪後相同條件再離心一次。 4 加入100ul nuclear extration buffer(20mM HEPES, 0.2mM EDTA, 10% glycerol, 1.5mM Mgcl2, 420mM NaCl,1mM DTT, 0.5mM PMSF)，冰上反應 30 min 期間不時震盪 5 12000rpm 4度C 15 min ，收上清液(nuclear protein) 離心轉速條件我的protocol上不管在哪一個步驟都是12000rpm ，但我看其他很多都至少使用10000g以上離心時間也是有長有短，我試過20000g 10 min 但跑wetern 出來還是一樣的結果. 以上是我萃核蛋白的過程，希望有萃組織核蛋白經驗的板友可以指教謝謝！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 59.126.60.2