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[討論] hif1 alpha實驗細節

看板Biotech (生命科學)作者 (jack)時間11年前 (2013/09/28 18:35), 編輯推噓7(7推 0噓 43→)
留言50則, 10人參與, 最新討論串1/1
請問板上有沒有大大正在壓hif1 alpha的 小弟目前已碩＂三＂ 急需壓出這個蛋白質 但是follow前人步驟已五個月 最多只壓出positive control(CoCl2) 有沒有人有壓出來過可以分享整個流程與細節的 若我成功壓出來願意請吃西提一份 感恩！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 118.169.215.4
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09/28 19:07, , 1F
postive有出來,negative沒看到,這兩個是做心酸的嗎？
09/28 19:07, 1F
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09/28 19:19, , 2F
我只有三個組別 positive,加藥組，control組
09/28 19:19, 2F
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09/28 19:23, , 3F
你聽不懂問題,你有三組,pc有,nc沒有,test也沒有,所以test是
09/28 19:23, 3F
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09/28 19:24, , 4F
跟pc比較像?還是跟nc比較像? pc/nc不就是方便你判斷結果嗎?
09/28 19:24, 4F
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09/28 19:28, , 5F
你一直把focus放在押不出來,可是你的問題幾乎與技術無關阿
09/28 19:28, 5F
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09/28 19:29, , 6F
而是你該前人的實驗為真,或是FascaXXX真的有效這兩件事上
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09/28 19:51, , 7F
三組皆該有band(前人已有做出證明）
09/28 19:51, 7F
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09/28 19:52, , 8F
但nc非常淡，pc and test要比較強的訊號
09/28 19:52, 8F
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09/28 19:53, , 9F
我是懷疑是技術問題所以壓不出來
09/28 19:53, 9F
推
09/28 22:23, , 10F
前人對還是positive control對，這個問題你還是沒回答
09/28 22:23, 10F
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09/28 22:23, , 11F
壓得出pc然後nc沒有，結論竟然是懷疑技術問題...呵呵
09/28 22:23, 11F
推
09/28 22:30, , 12F
先假設前人結果為真且可重複,那你是不是也該懷疑你
09/28 22:30, 12F
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09/28 22:31, , 13F
細胞狀況跟藥的效果是否有變?
09/28 22:31, 13F
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09/28 22:54, , 14F
前人跟pc皆對阿！只要有band在120KDa就是對
09/28 22:54, 14F
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09/28 22:55, , 15F
以我的處理pc nc 加藥 三種都要在120KDa有band 強弱而已
09/28 22:55, 15F
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09/28 22:57, , 16F
細胞剛解凍不久 代數不高 就算藥物有壞好了 nc組也該要
09/28 22:57, 16F
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09/28 22:58, , 17F
因為endogenous 就有 並不是要induce才有
09/28 22:58, 17F
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09/28 22:59, , 18F
我懷疑自己技術是因為hif1很容易degrade 但我已盡量小心
09/28 22:59, 18F
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09/28 22:59, , 19F
所以不知道是不是有遺漏什麼 所以才想請教有做過的人
09/28 22:59, 19F
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09/28 23:59, , 20F
你是有沒有確認過細胞種類,load量,ECL品牌...等等所有東西
09/28 23:59, 20F
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09/29 00:00, , 21F
都跟前人一樣那才有相互比較的空間,不過都一樣的話幹嘛還補
09/29 00:00, 21F
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09/29 00:01, , 22F
這data就很有趣了,此外,你的這兩篇文應該要問如何看到HIF1
09/29 00:01, 22F
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09/29 00:01, , 23F
因為要repeat完 才能做接下來的實驗啊@@"
09/29 00:01, 23F
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09/29 00:02, , 24F
的endo level,結果發文內容完全不是提到這一點,卻都提加藥
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09/29 00:03, , 25F
我要對HIF的上游做調節 所以總要先押的到HIF
09/29 00:03, 25F
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09/29 00:04, , 26F
HIF 在ENDO是不斷被做出來又不斷被DEGRADE的蛋白
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09/29 00:04, , 27F
所以收lysate很容易不小心離開冰上就被分解
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09/29 00:05, , 28F
我的實驗室根據今年畢業同實驗室學長的題目做延伸
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09/29 00:05, , 29F
藥品不用說都是他留下來的 但是他人間蒸發 無法問到細節
09/29 00:05, 29F
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09/29 00:07, , 30F
我沒著重在加藥這件事上面....但是加藥組也是我要看的啊
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09/29 00:08, , 31F
我的加藥跟PC都是去抑制HIF被分解的途徑
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09/29 00:08, , 32F
所以一個有一個沒有BAND讓我很困惑!!!
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09/29 09:16, , 33F
1.藥壞掉了 2.此藥無抑制分解效果
09/29 09:16, 33F
推
09/30 08:50, , 34F
您對本實驗有預設立場，對此小弟我也很困惑。
09/30 08:50, 34F
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09/30 08:51, , 35F
既然你都說pc跟您使用的藥一樣都會抑制分解，結果卻不同
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09/30 08:52, , 36F
實在很難聯想到實驗手法問題，比較傾向細胞or藥or else
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09/30 09:04, , 37F
不是預設立場 是因為這是要repeat一個一模一樣的實驗
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09/30 09:06, , 38F
是半年前一個同lab的人做的論文data（目前已畢業已失聯
09/30 09:06, 38F
推
09/30 16:08, , 39F
那就是他有問題啦 科科
09/30 16:08, 39F
推
09/30 21:06, , 40F
那就是他有問題啦 科科
09/30 21:06, 40F
推
09/30 22:38, , 41F
相信我,很多人即使他不是有意的,他的實驗結果仍然是
09/30 22:38, 41F
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09/30 22:39, , 42F
沒辦法重複甚至是相反的...
09/30 22:39, 42F
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09/30 22:41, , 43F
如果這結果你有看到其他paper做出類似的結果,那你
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09/30 22:43, , 44F
可以推測你的方法/材料出問題,所以再找找文獻吧
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09/30 23:22, , 45F
我也不覺得一定是前人的問題,因為原po連細節都不清楚未提及
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09/30 23:22, , 46F
一直在"這是repeat別人實驗"上跳針,那乾脆去八卦人肉還更快
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09/30 23:26, , 47F
如果清楚說明自己材料與方法很難,那要repeat實驗應該也不易
09/30 23:26, 47F
推
10/01 09:26, , 48F
生物實驗倒是三不五時會有那種in his hands only的結果
10/01 09:26, 48F
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10/02 11:12, , 49F
印象中這個protein degrade很快,取蛋白盡量能多低溫就多低
10/02 11:12, 49F
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10/02 11:13, , 50F
用液態氮更好
10/02 11:13, 50F
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