[求救] Annexin V-FITC/PI跑流式細胞儀

看板Biotech (生命科學)作者sss79818 (Sosad)時間11年前 (2014/03/07 20:37)推噓2(2推 0噓 8→)

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不好意思有幾個問題想請教一下各位大大小弟最近在用流式細胞儀看細胞死亡途徑時遇到了一些問題我的實驗是用光動力治療在細胞體內產生自由基來殺死Hela cell 實驗的設計是在照光後6 hr/24 hr收集起來染完Annexin V-FITC/PI之後去跑flow來判斷細胞的死亡途徑但是因為flow儀器預約時段的關係我是把照光後6hr的細胞在染色完之後fix起來保存到隔天把24hr的細胞染完之後再一起拿去跑結果在用positive control(這組也是前一天染的)抓gate的時候發現不管是單染FITC或是雙染的組別都看不到FITC的訊號而單染PI與雙染的組別則都抓的到PI的訊號這應該代表我positive control的作法沒有問題? (kit裡的protocol是說把細胞泡在3.7% formaldehyde裡面冰浴30min) 如果protocol沒問題的話只看的到PI 沒有FITC是很怪的一件事我有問過實驗室學長他是說FITC染完之後放到隔天太久這樣訊號會變很弱他建議先fix起來隔天要上機之前再染這邊我有個問題如果先fix的話膜的結構會不會受到影響? 我們fix都是用3.7% formaldehyde固定20分鐘而positive control也是用formaldehyde做而且已經證實染的到PI 這樣不就代表膜已經受損到足以讓PI通過了嗎? 這樣先fix再染會不會讓普通的正常細胞也變成FITC+/PI+? 我們學長是說他沒染過apoptosis 他不知道這樣會不會有影響如果會有影響的話以各位的經驗FITC在染色完畢之後避光4度C保存大概能撐幾小時呢? 另外細胞凋亡在啟動6小時後應該仍是會處在早期膜外翻的狀態嗎? 我查過一些光動力治療相關的paper 有的抓照光後5小時後觀察有的抓6小時後觀察不曉得抓6小時這個時間點O不OK? 問題有點多麻煩大家了 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.182.185