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[求救] DNA 純化問題 (DNA extraction kit)

看板Biotech (生命科學)作者 (ayenya)時間10年前 (2014/03/13 14:03), 編輯推噓8(8推 0噓 55→)
留言63則, 14人參與, 最新討論串1/1
目前我正進行cloning 將某PCR片段塞進某plasmid 目前遇到的問題是 我把 1 ug plsmaid用restriction enzyme (總體積10 ul) 切過之後 將之進行純化 利用Geneaid Gel/PCR DNA Fragmants Extraction Kit 1. 首先與DF buffer 混合 2. 再過 DF column 離心 6000g 30s 3. 用75%EtOH wash buffer清洗 離心 6000g 30s 4. 以最高速離心(2 min)方式風乾後 加入ddH2O或elution buffer 5. 靜置 2 min 等 DF colume 的 filter 吸收 6. 以最高離心將DNA溶出 但所得之DNA濃度很低 僅0.010 ug/ul 260/280 = 2.3 260/230 = 0.1 目前不知道出甚麼問題 純化前跑膠也的確有正確的band (4000 bp) 另外我純化PCR products(600~1000bp)是正常的 使用其他廠牌純化kit也是相似結果 想來請教各位有經驗的前輩 感謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.25.228
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03/13 14:55, , 1F
我覺得純化完 10 ng/ul還滿正常的阿XD
03/13 14:55, 1F
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03/13 14:56, , 2F
忘記問你是只切一刀 還是切一段下來?
03/13 14:56, 2F
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03/13 14:57, , 3F
我覺得你什麼都沒寫,先猜你用100ul,結果就正常
03/13 14:57, 3F
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03/13 15:05, , 4F
不過打這麼多字,卻沒有提到你PCR那部分是怎樣的正常
03/13 15:05, 4F
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03/13 17:23, , 5F
我用10ul回溶 只切一刀
03/13 17:23, 5F
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03/13 17:26, , 6F
PCR 產物純化後 用20ul回溶都還有0.2 ul/ug
03/13 17:26, 6F
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03/13 17:28, , 7F
主要是切過的plasmid yeild不到10% 感覺有點疑惑
03/13 17:28, 7F
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03/13 17:29, , 8F
我有試過一次切10ug的plasmid然後去純化 產量也無提升
03/13 17:29, 8F
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03/13 18:25, , 9F
為何只用10ul回溶？你有看說明書嗎
03/13 18:25, 9F
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03/13 18:56, , 10F
如果這10ul是自己決定的,我想猜這實驗從切plasmid就不順利
03/13 18:56, 10F
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03/13 19:57, , 11F
10 是學長做過是可行的 所以照做
03/13 19:57, 11F
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03/13 19:58, , 12F
我試過照說明書用50也是一樣
03/13 19:58, 12F
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03/13 20:19, , 13F
看不太懂是做gel extraction還是單純clean up
03/13 20:19, 13F
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03/13 20:45, , 14F
gel extraction 跟 clean up 結果都是相同的
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03/13 22:15, , 15F
你可以試試看加多點水50-100純化後再風乾 這樣應該可以
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03/13 22:16, , 16F
回收比較多
03/13 22:16, 16F
推
03/13 22:22, , 17F
可以把步驟六的產物 再回到步驟四做一遍,也就是
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03/13 22:22, , 18F
elution 2次
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推
03/13 22:30, , 19F
回溶的時候60-65℃加熱一兩分鐘
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03/13 23:37, , 20F
有點好奇既然處理PCR的部分沒問題,又這plasmid換別kit也同
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03/13 23:38, , 21F
樣狀況,怎麼會猜測是extraction kit的問題? 標題引導了答案
03/13 23:38, 21F
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03/13 23:45, , 22F
而且如果已用了50,卻只先說10ul,只會引導出你已試過的方向
03/13 23:45, 22F
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03/13 23:48, , 23F
另外文中的流程跟gel extract差一個W1步驟,這也是模糊的點
03/13 23:48, 23F
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03/13 23:51, , 24F
總之現有的嘗試你應該試過不少了,你如何懷疑問題在這kit？
03/13 23:51, 24F
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03/14 09:12, , 25F
你有試過拿純化後的產物去跑膠嗎？load 個 5/10 ul 試試
03/14 09:12, 25F
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03/14 09:23, , 26F
我文中應該沒說我懷疑kit有問題QQ
03/14 09:23, 26F
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03/14 09:25, , 27F
是想問說有沒有其他可能可以改善的點
03/14 09:25, 27F
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03/14 09:26, , 28F
純化後的plasmid 我全load跑膠是啥都看不見
03/14 09:26, 28F
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03/14 09:30, , 29F
另外感謝上面的建議 我有試過可以提升一點點的產量
03/14 09:30, 29F
推
03/14 10:21, , 30F
我有個問題... 為何binding和washing離心的轉速只有6000g?
03/14 10:21, 30F
推
03/14 22:03, , 31F
我用一樣的kit 切完之後會先跑膠 切下之後再回收
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03/14 22:04, , 32F
離心都是用13000rpm
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03/14 22:08, , 33F
我的plasmid大小是4.5k 所以回收這個大小是沒問題的
03/14 22:08, 33F
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03/14 22:09, , 34F
純化後是測不太到 但是loading是有band的
03/14 22:09, 34F
推
03/15 03:25, , 35F
膠回收可能有問題 沒溶乾淨的話 純化前的量就少了
03/15 03:25, 35F
推
03/15 03:29, , 36F
膠回收可到70度, 回溶的水65-70度
03/15 03:29, 36F
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03/15 08:44, , 37F
感謝各位幫助 轉速是按照protocol所做
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03/15 08:47, , 38F
溶膠與回溶溫度問題有試過了 但無改善
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03/15 08:49, , 39F
目前我只能重複一直做 做到有成功ligation&transformat
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03/15 08:49, , 40F
ion
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03/15 14:07, , 41F
加 DF 後加熱 60~65℃，每 1 分鐘 vortex 一次直到完全
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溶解，再 vortex 後 spindown，然後放到 4℃ 降溫後再過
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03/15 14:10, , 43F
column。 這是我的做法，我之前發現如果融膠後的 DF 溫
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03/15 14:10, , 44F
度太高，會讓 DNA 回收的產量減少。
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03/15 17:39, , 45F
我說的kit問題是抽kit過程的問題,不是kit本身,你的標題寫著
03/15 17:39, 45F
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03/15 17:40, , 46F
DNA extraction kit,內容又附kit流程,當然會引導這個方向
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03/15 17:41, , 47F
既然你不覺得kit本身,抽的流程又與PCR一樣,何不探討plasmid
03/15 17:41, 47F
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03/15 17:43, , 48F
切之前的濃度,切後的狀況,以及不切,等同濃度直接跑膠純化?
03/15 17:43, 48F
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03/15 17:47, , 49F
或許你也可能都試過了就是(只是你文章也沒說試過這些)
03/15 17:47, 49F
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03/15 17:52, , 50F
其實第一個推文就寫了,而且做cloning,10ng/ul已經很夠用
03/15 17:52, 50F
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03/15 17:53, , 51F
比較覺得怪怪的地方反而是你的PCR竟然純化出4ug,大概只有特
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03/15 17:55, , 52F
殊實驗才會這樣,這應該pool很多管吧,一般用途反而怪怪的
03/15 17:55, 52F
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03/15 17:57, , 53F
而且你做clone,一般雙切只有10ul,很難避免star activity
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03/15 17:57, , 54F
如果RE有千放少,也會擔心切不好;若只是單切,那追求高濃度反
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03/15 17:58, , 55F
而造成之後self-ligate的現象增多(尤其你切完沒說有CIP)
03/15 17:58, 55F
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03/15 18:03, , 56F
附帶一提,plasmid的4k都是假設切完前後一致,該不會差很多吧
03/15 18:03, 56F
推
03/17 09:45, , 57F
單切一定要做CIP(or AP) 挑過1k顆菌cPCR的路過
03/17 09:45, 57F
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03/17 09:47, , 58F
老實說, 我切膠純化的回收率不知為啥總是很低25%-40%
03/17 09:47, 58F
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03/17 09:51, , 59F
OD260/230 時常過高(<1) 初始low melting gel重<300mg
03/17 09:51, 59F
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03/17 09:52, , 60F
最後wash也兩次 13k rpm 3mins後 還會65度C 乾3mins
03/17 09:52, 60F
推
03/17 09:57, , 61F
有時候水加下去會在膜表面形成水珠 吸不下去 有解嗎QQ?
03/17 09:57, 61F
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03/18 00:59, , 62F
只憑回收率太低有太多可能;水無法吸收則是膜太乾了
03/18 00:59, 62F
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03/27 18:47, , 63F
切膠用的gel先借別人家的不同牌的,看是不是純度不良
03/27 18:47, 63F
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