[求救] DCFH-DA染ROS

看板Biotech (生命科學)作者sss79818 (Sosad)時間11年前 (2014/03/19 00:15)推噓1(1推 0噓 0→)

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不好意思有個問題想請教一下各位我最近在用DCFH-DA來偵測光動力治療在細胞內產生的ROS 實驗是使用搭載亞甲基藍的奈米粒子在先前的實驗中已經證實過在溶液裡經過雷射刺激後會產生ROS了 DCFH-DA是跟sigma買的買回來之後是先在酒精裡面配成10 mM溶液再用PBS稀釋10倍成1 mM stock solution 平常是冰在-20度C冰箱裡避光保存實驗protocol如下: 1.Hela cell seeding density: 5000#/well in 96 well plate Culture medium: DMEM high glucose w/ 10% FBS and 1% PSA 2.After 1 day of incubation, these cells were incubated with mixed solution of culture medium (w/o FBS) and DCFH-DA stock solution at a ratio of 100:1 for 30 min in incubator 3.PBS washed x3 to remove excess DCFH-DA. 4.加入搭載亞甲基藍的奈米粒子培養2hr 5.把奈米粒子移除掉之後，每格加入少許PBS以防止well完全乾掉 6.以660nm雷射照射4分鐘激發亞甲基藍以產生ROS 7.用螢光顯微鏡觀察我在進行到第三步的時候發現細胞幾乎全部都被洗掉了一開始以為是洗3次太多我就改成只洗一次沒想到還是掉光了硬著頭皮做下去那些極少數還沒掉的細胞的螢光強度也是非常非常低實驗組與控制組之間幾乎沒有差異在進行實驗之前我都有先用顯微鏡觀察過Hela cell 貼附情形都還蠻不錯的所以應該不是細胞健康狀況的問題我稍微查過一些文章發現有人DCFH-DA是配在DMSO裡面第二步那邊有人是用PBS來稀釋請問會是這些原因嗎? 我們LAB裡面沒有人做過只好上來求救了感謝各位 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 112.104.64.239