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[求救] PCR產物與primer設計

看板Biotech (生命科學)作者 (鳥松吳尊)時間11年前 (2014/04/23 13:06), 11年前編輯推噓2(2推 0噓 15→)
留言17則, 7人參與, 最新討論串1/1
大家好 事情是這樣的 原先有一條cDNA序列(RACE做出的) 而且有一組primer 跑PCR可以夾出一段序列(約120bp) 但用該組primer跑PCR卻夾不出gonome DNA (怎麼跑band都在100bp以下....超煩) 我也試過以不同annealing溫度夾出120bp片段 但不是雜band一堆 就是只夾出100bp以下 的片段 所以我又另外以cDNA序列設計一組primer 位置大概是原先primer兩邊擴展30-40bp的地方 想說先以該段primer夾出一段序列(約220bp) 在稀釋PCR產物(100倍) 再以巢氏PCR原先的 primer夾出目標序列(120bp) 剛剛試了不同annealing (分別為48,50,52,54,56,58)且使 用後來設計的primer夾出220bp 卻又夾不到目標序列(220bp) 想請問大大有沒有其他方法可以改善QQ 不懂我到底出了什麼問題? 或許一開始夾出120bp的primer的condition可以改善QQ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.80.2 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1398229576.A.910.html ※ 編輯: zodiac123 (140.112.80.2), 04/23/2014 13:08:44
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04/23 13:09, , 1F
我有沒有看錯?@@ 你要拿夾cDNA的primer去夾genoimc DNA???
04/23 13:09, 1F
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04/23 13:11, , 2F
你是認真在問的嗎??
04/23 13:11, 2F
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04/23 13:45, , 3F
intron可能很大一條或N條，或者是你cDNA的primer剛好卡
04/23 13:45, 3F
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04/23 13:45, , 4F
在intron-exon的boundary都可能P不出來。
04/23 13:45, 4F
推
04/23 15:26, , 5F
你cDNA primer要挾gDNA，除非一開始你就設計在exon上
04/23 15:26, 5F
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04/23 21:27, , 6F
用cDNA的primer去夾gDNA,不可能P出你要的120跟220吧..
04/23 21:27, 6F
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04/23 21:27, , 7F
你說後來設計的夾到220有送定序確認是你要的嗎?
04/23 21:27, 7F
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04/23 23:05, , 8F
cDNA沒有intron 所以primer會設計在exon上
04/23 23:05, 8F
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04/23 23:06, , 9F
每次p出來都只有小於120bp的band 照理講應該要等於或者
04/23 23:06, 9F
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04/23 23:06, , 10F
大於 有可能primer卡在 intron-exon的地方 感謝大大QQ
04/23 23:06, 10F
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04/23 23:08, , 11F
To V大 因為band的bp數都是小於原先預設的 所以沒送
04/23 23:08, 11F
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04/23 23:09, , 12F
照理講應該要大於或等於阿~~~~好苦惱
04/23 23:09, 12F
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04/23 23:34, , 13F
你是真的講cDNA沒有intron？還是要講primer沒有跨intron？
04/23 23:34, 13F
推
04/24 01:47, , 14F
本文跟推文一起看看不懂,所以你primer設計到底有沒有
04/24 01:47, 14F
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04/24 01:47, , 15F
跨intron?
04/24 01:47, 15F
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04/24 08:54, , 16F
小於 100 bp 我認為是 primer dimer 比較有可能
04/24 08:54, 16F
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04/24 09:40, , 17F
不太知道有沒有跨到intron...
04/24 09:40, 17F
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