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[求救] trizol抽DNA產量很低, quality也不好

看板Biotech (生命科學)作者 (so many things)時間11年前 (2014/08/06 16:16), 編輯推噓6(6推 0噓 19→)
留言25則, 8人參與, 最新討論串1/1
想同時從同樣的樣品裡抽DNA 和RNA,所以選了trizol RNA沒問題,但是DNA問題很大 我跟著使用手冊做 使用的trizol量是1ml 1. 加入100% EtOH 300ul, 搖勻, 室溫incubate 3分鐘後12,000rpm 離心5分鐘 2. 倒掉上清液, 加入1ml 10% EtOH, 0.1M sodium citrate溶液洗pellet, 室溫轉30分鐘, 12,000rpm離心5分鐘 3. 倒掉wash, 加入1ml 75% EtOH, 室溫轉20分鐘, 12,000rpm離心5分鐘 4. 倒掉wash, 用p200移掉剩餘的酒精,室溫放2-3分鐘等pellet乾 5. 用 50 ul TE回溶 問題: 1. pellet溶不乾淨 2. 抽出來的DNA用RNase A處理過東西剩很少, DNA產量只有直接用kit抽的可能5% 3. 有人用這樣的DNA做過NGS的library嗎? 煩請有經驗的前輩幫我解答疑問 非常感謝!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 137.189.43.181 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1407312974.A.81F.html
推
08/06 16:36, , 1F
經驗就是 不要用trizol抽DNA
08/06 16:36, 1F
推
08/06 16:50, , 2F
步驟三那邊，室溫20min似乎太久？麻煩您確認一下
08/06 16:50, 2F
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08/06 16:54, , 3F
http://ppt.cc/gE9e EtOH wash看起來是10-20分鐘
08/06 16:54, 3F
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08/06 16:54, , 4F
如果不用trizol, 有其他方式可以同時抽DNA和RNA又不會太貴嗎?
08/06 16:54, 4F
推
08/06 17:07, , 5F
分兩個組別 一邊抽ＤＮＡ一邊ＲＮＡ？
08/06 17:07, 5F
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08/06 17:13, , 6F
我們lab有用phenol-chloroform方式抽dna送ngs,理論
08/06 17:13, 6F
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08/06 17:14, , 7F
上這是最能保存完整片段以及最大的方法,所以應是沒
08/06 17:14, 7F
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08/06 17:15, , 8F
問題(但不是用trizol),同時抽dna, rna有kit(Qiagen)
08/06 17:15, 8F
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08/06 17:17, , 9F
但過membrane就是會讓你損失一些片段,我自己有用過
08/06 17:17, 9F
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08/06 17:17, , 10F
trizol同時抽dna跟rna,沒有你的問題,dna量很大也很好
08/06 17:17, 10F
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08/06 17:18, , 11F
請問syl,你用的protocol是根據invitrogen的還是有其他的?
08/06 17:18, 11F
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08/06 17:19, , 12F
kit真的不便宜@@
08/06 17:19, 12F
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08/06 17:21, , 13F
我是用invitrogen的,不曉得你有沒有看protocol說
08/06 17:21, 13F
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08/06 17:22, , 14F
resuspension不能用水或是tris buffer呢？要用8mM
08/06 17:22, 14F
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08/06 17:23, , 15F
NaOH at a concentration of 0.2-0.3 ug/ul?
08/06 17:23, 15F
推
08/07 09:42, , 16F
對不起 小弟實在眼殘 我找不到75%Etoh轉10-20
08/07 09:42, 16F
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08/07 09:42, , 17F
請指點一下 嗚嗚屋～
08/07 09:42, 17F
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08/07 10:28, , 18F
to syl: 我晚點試試用NaOH, 一直以為那是為了除去RNA
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08/07 10:29, , 19F
to biingru: 在DNA wash 第五步到第六步
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還是我眼花了＠＠？
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08/07 16:15, , 21F
to syl:剛剛試完還是不行@@,產量還是很低,看起來是無解了
08/07 16:15, 21F
推
08/07 20:07, , 22F
SERVA有Kit還滿好用的 可以試試
08/07 20:07, 22F
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08/08 00:15, , 23F
不能分開抽嗎?要送ngs的不要省吧
08/08 00:15, 23F
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08/14 19:30, , 24F
Tri reagent XD
08/14 19:30, 24F
推
10/23 16:29, , 25F
用CTAB
10/23 16:29, 25F
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