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[求救] 抽取 E.coli K12 wild-type DNA

看板Biotech (生命科學)作者 (sharkhsu)時間11年前 (2014/09/01 15:59), 11年前編輯推噓3(3推 0噓 6→)
留言9則, 4人參與, 最新討論串1/1
小弟抽了幾次DNA，但出來的濃度(約35)和260/280(約1.35)都非常低，感覺都沒有順利抽出。 所以想請問各位前輩，還有什麼方式能改善產率呢!? 採用:Protech-Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit給的protocol 步驟如下: 1.將離心後的菌塊加入(20mM Tris-HCl, 2mM EDTA, 1%triton X-100, 20mg/ml lyspzyme) 100μL 2.放置37度30-60 min 3.加入350μL Extraction Buffer 4.加入4μL proteinase K 溫和搖晃 5.放置56度1-3h 6.加入300μL DNA binding buffer 7.將溶液轉移至spin colimn和collection tube, 14000 rpm 離心1min 丟棄下層液 8.加入700μL Wash Solution 離心丟棄下層液後再離心5 min 9.移去collection tube, 將spin column放置microcentrifuge 10.加入50-100 μL DI水 or TE, 離心1 min後保存 之前有試過用酒精洗一次就好，但效果還是不明顯..所以想請問各位前輩 還有什麼方法可以改善的嗎!? proteinase有必要再放更久嗎!?之前都放三小時.. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.123.126.146 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1409558395.A.ADE.html ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/01/2014 16:01:22 ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/01/2014 16:02:32
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09/01 17:28, , 1F
E. coli加 proteinase K? 應該要加RNase吧 拿錯kit?
09/01 17:28, 1F
呃...所以不能用proteinase k嗎? 因為我是去其他實驗室借kit用的.. protocol上面確 實也寫菌是用proteinase k 冏 ※ 編輯: shunminhsu (114.33.254.137), 09/01/2014 17:48:45 ※ 編輯: shunminhsu (114.33.254.137), 09/01/2014 18:14:26
推
09/01 20:36, , 2F
你知道用pk的目的嗎?
09/01 20:36, 2F
呃 ... 是知道 .. 但無法確定可不可行 ※ 編輯: shunminhsu (114.33.254.137), 09/01/2014 20:57:50
推
09/01 22:03, , 3F
在加PK前 溶液應該還是混濁的 PK作用完後會變澄清
09/01 22:03, 3F
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09/01 22:04, , 4F
就你觀察 有這樣嗎?
09/01 22:04, 4F
有這個現象沒錯.. 加完binding buffer後有再離心..瓶底的白色塊狀挑掉.. 但總覺得我在用Wash Solution洗完，整個DNA都不見了..最後加完DI水， 感覺都沒有回溶到。 ※ 編輯: shunminhsu (114.35.162.46), 09/02/2014 05:13:29 ※ 編輯: shunminhsu (114.33.254.137), 09/02/2014 09:14:25
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09/02 10:09, , 5F
column based就是產量不高 DNA進column離心前擺涼擺久
09/02 10:09, 5F
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09/02 10:10, , 6F
一點 elution bfr熱一點擺久一點 可以提高一點產量
09/02 10:10, 6F
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09/02 10:10, , 7F
如果真的需要大產量還是用傳統法吧
09/02 10:10, 7F
謝謝建議，但現在疑惑是染色體DNA抽出來濃度應該要很濃才對...但是我的既不純 又不濃，這應該不算正常吧!? ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/02/2014 10:19:53
推
09/02 11:52, , 8F
binding buffer 成份是? 原始protocol有說加入後要離心嗎？
09/02 11:52, 8F
DNA binding buffer - 20 mL (8M Guanidine HCl), protocol是說有些組織(這邊舉例班 馬魚、植物纖維)的碎片比較難digest, 所以藉由離心以後再把澄清液放到spin column. 财 ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/02/2014 12:00:49
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09/02 12:22, , 9F
你的column就只能抓這麼多啊
09/02 12:22, 9F
呃..今天抽出來的值正常多了..但正常DNA要保存在-20還是4度C呢?滿多人都說-20, 但又有人說-20會產生冰晶..怕解凍完會影響濃度.. ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/02/2014 12:31:38
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