[求救] 蛋白質表現出來做成抗體染IHC的問題

看板Biotech (生命科學)作者 (太人生了)時間11年前 (2014/12/11 15:29), 編輯推噓4(4021)
留言25則, 7人參與, 最新討論串1/1
大家好 最近收到之前 把表現出來的蛋白質給抗體公司 做成的抗體 拿來試染 我用的是Biogenex的系統 用DAB呈色 先拿PCR陰性的片子來試染 把原液稀釋5000X 10000X 25000X 50000X來試染 看背景有沒有上 想不到染出來,整片有組織的地方都上了..又稠又濃 根本無法辨認 請問我下一步 該怎麼trouble shooting.. 因為失敗所以還有一個疑問: 我自己生產出來的一抗, 可以接上comerical kit的二抗嗎 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.96.58 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1418282975.A.9E7.html

12/11 20:11, , 1F
有做過用lysate與其他如WB測試效力或專一性嗎?
12/11 20:11, 1F

12/11 20:21, , 2F
這樣問是無助於解決IHC問題,但應該沒算超出你的問題範圍
12/11 20:21, 2F

12/11 22:01, , 3F
同一樓 先做wb至少看一下會有幾條band
12/11 22:01, 3F

12/11 22:03, , 4F
自己產的抗體物種對 買來的二抗是可以認的到的
12/11 22:03, 4F

12/11 22:05, , 5F
還有DAB呈色時間要抓一下 有時會太強
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12/11 22:06, , 6F
另外想到你有用3% H2O2 這個步驟嗎?
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12/11 22:06, , 7F
上面%數不確定(更正一下
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12/11 23:11, , 8F
二抗前wash久一點... 可以洗到兩三天
12/11 23:11, 8F

12/12 18:04, , 9F
1.先作western 2.你的蛋白如何表現純化 可以說明一下嗎@@?
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12/12 18:05, , 10F
我前lab有人請公司作一抗 然後丟給他們SDS-PAGE切下來的膠
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12/12 18:06, , 11F
搞了很久才知道原來是彼此都沒純化XD~ 重用一批就好多了
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12/12 20:27, , 12F
如果以上方法都無法解決問題,可以試著用你原本的抗原
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對抗體進行純化。因為IHC的抗原都是folding完整的,應
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該會與你純化的抗原非常相似,所以經過的純化的抗體會
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12/12 20:27, , 15F
比較好使用!
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12/12 22:03, , 16F
可考慮用DAKO的 二抗……我認為 好用 。背景值又乾淨。大
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12/12 22:04, , 17F
推……現在的代理商 比之前的代理商 便宜 超多的!又專業:-
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12/12 22:05, , 18F
保吉@@? abcam自家沒有推薦貨嗎?? XD~
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12/13 04:03, , 19F
有用lysate做WB, 都OK
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12/13 04:03, , 20F
DAB我可以試試時間少一點 謝謝, 有H2O2這步驟
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12/13 04:05, , 21F
PAGE的產物是通管柱, histag來抓的純化產物
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12/13 04:06, , 22F
現在只有第六針的sample,之後全採血才會抗體純化
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12/13 04:06, , 23F
我用DAKO的二抗沒錯, 蟹蟹大家 我繼續找問題
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12/13 04:09, , 24F
純化是E.coli的系統
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12/13 04:09, , 25F
更正: 表現是用E.coli的系統
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文章代碼(AID): #1KYKVVdd (Biotech)
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