[求救] 有關gene deletion kit實驗

看板Biotech (生命科學)作者polomi (polomi)時間11年前 (2014/12/15 13:35)推噓0(0推 0噓 3→)

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目的是為了替除掉特定的目標蛋白。使用的菌種是E. coli K-12 所使用的KIT是Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit http://www.genebridges.com/products/quick-easy-e-coli-gene-deletion-kit 基本上我都按照上面的protocol去做，前面送重組質體的部分，已經很順利地送了進去，也有作對照的部分，原本的菌種是沒有抗amp抗性的表現，培養時溫度也都控制在30度，也有拿溫度計做校正。主要是在第二次電穿孔時，送進去PCR好的片段進入，這個片段有先跑膠，並切膠純化出來。使用的純化KIT是 GeneMark的DNA Clean/Extraction KIT 也全部都按照此上面建議使用， Elution solution也是使用KIT所附上的。測量OD260時，因為濃度過低，添加的體積約為3~6ul的使用。電穿孔也是按照原本protocol所述1350V，但是因為我們的機器沒有辦法調整ms的時間，有時會到10ms，主要是做了數次後，再塗盤後，還是都沒有clone的產生。請問，會是我的primer設計有錯誤? 還是我的PCR條件有問題? 我的PCR是使用ACCU DNA POLYMERASE，也有請教過有含有高保真性質的能力。條件是一開始 5分鐘 95度，接下來30cycle 95度30秒 60度30秒 70度2分鐘之後 70度7分鐘跑膠後，在大約1.5K之上有一條BAND產生，但是在低於0.5K之下有一團模糊的團塊。我有針對這個部分做了切膠。只是之後濃度頗低，所以添加的體積略高於原廠的建議值1~2ul。想請問使否會有所影響? PCR的條件要在改變? 還是我原本的primer設計失敗? 辨識位置的50bp過短? 請問我這樣還有哪裡要改善的或是有重大問題? 或是請教大家有無好的濃縮片段方式? 感謝大家了~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.107.165.123 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1418621705.A.B4E.html