[求救] IAA immunolocalization
各位好，小弟的實驗接下來會探討到生長素在水稻根尖的分布
所以打算利用可以辨識IAA的抗體來抓根尖切片組織中的IAA，
整個實驗過程有幾個問題想問一下各位，
然後最底下是我目前搜尋參考資料後整理出來後的PROTOCOL
還麻煩各位多多指導
1. paraformaldehyde可以用formaldehyde取代嗎?
看上面一些相關的文章，好像是可以，不過確保起見還是再這邊問一次
2. EDAC [ 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide ]
此化合物用途為固定組織內的IAA (以及ABA之類的賀爾蒙)
我問了台灣代理SIGMA的廠商，他說他們只賣EDAC-Hydrochloride
或者其他相關的衍生物，就是沒有單純賣EDAC，
請問用EDAC的衍生物會有一樣的效果嗎?
或者有沒有其他也具有EDAC效果的化合物呢?
3. protocol中說要使用百分之百的純酒精來進行切片的脫水
可是目前sigma也只有產99.99%的酒精
差了那麼一點點的酒精，對於切片與後續抗體染色處理會有影響嗎?
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以下是我整理的protocol
[樣本前處理]
1.將取下之材料以4% (w/v) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC; Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)
之PBS緩衝溶液 (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 7.9 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4，
pH 7.3) 置於冰上浸泡1小時。
2.以3% (w/v) paraformaldehyde，4% (w/v) EDAC，0.1% (v/v) Triton X-100
(Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 浸置取下之樣本，置放4℃下24小時。
[包埋與切片]
1. 以PBS 緩衝溶液清洗樣本三次，每次十分鐘。
2. 依序以25, 50, 75, 100% 乙醇浸泡樣本，每次處理5分鐘，使樣本逐漸脫水。
※ 須以PBS溶液來進行不同濃度乙醇之配置。
3. 於室溫中以漸減濃度之ethanol 及 xylene 處理樣本，
3-1 以ethanol : xylene ( 3:1 ) 浸泡樣本60分鐘
3-2 以ethanol : xylene ( 1:1 ) 浸泡樣本60分鐘
3-3 以ethanol : xylene ( 1:3 ) 浸泡樣本60分鐘
4. 將樣本包埋入cryostat medium (Tissue-Tek, Killik; Sakura Finetek USA,
Inc., Torrance, CA, USA)
4-1 加入1/4體積之paraplast chips於管中，於室溫下隔液培養。
4-2 將樣本管置於37℃ 環境中，待paraplast chip完全溶解後，
再加入1/4體積之paraplast chip進入，於室溫下培養4小時，
隨後再置於42℃環境中培養2小時。
4-3 倒去1/4體積之溶液，再加入1/4體積之parachips，並將以42℃之環境隔夜處理。
※ 準備paraplast chips 於58℃之環境中，待隔日使用。
4-4 提高溫度至48℃，移去1/4體積之溶液，加入paraplast chips，靜置4小時。
4-5提高溫度至52℃，移去1/4體積之溶液，加入paraplast chips，靜置4小時。
4-6提高溫度至58℃，移去所有溶液，將樣本置入溶解之純paraplast chips中。
4-7 於2日內更換三次paraplast，於最後一次更換paraplast後，調整樣本角度，
完成包埋。包埋之樣本密封後可至於常溫下長時間保存。
5. 以切片機進行切片，每份樣本寬度為50 μm，切片後之樣本可置於4℃中保存。
6. 將polysine slides以42℃加熱後，滴幾滴蒸餾水於其上，
將切片樣本至於蒸餾水滴上，使其平整張開。
7. 迅速移去多餘水分後，使樣本切片在37℃環境中隔夜烘乾。
抗體染色
1. 以25, 50, 75, 100% 乙醇依序清洗，每次5分鐘。
2. 以含有0.1% (v/v) Tween 20之PBS緩衝溶液清洗樣本30分鐘，
再以PBS buffer清洗10分鐘。
※ 除蠟完畢後，確認細胞有無受損，勿用有受損之細胞組織進行抗體染色。
3. 以含有5% (v/v)之bovine serum albumin (BSA; sigma-Aldrich Co., St Louis,
MO, USA)之PBS 浸潤樣本30分鐘，藉以減少non-specific binding。
接著與IAA primary antibody浸潤過夜。
4. 浸潤完畢後以含有0.1% (v/v) Tween 20之PBS 緩衝溶液潤洗10分鐘。
5. 將樣本以次級抗體於黑暗下浸潤1小時。
6. 以含有0.1% (v/v) Tween 20之PBS 緩衝溶液潤洗10分鐘兩次。
7. 潤洗完後，立即以顯影劑浸潤樣本。
8. 即可以解剖顯微鏡進行觀察。
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※ 編輯: asojoe (140.112.99.150), 01/07/2015 16:15:26
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