[求救] siRNA transfection問題

看板Biotech (生命科學)作者swoopsky (楊P)時間11年前 (2015/02/21 15:30)推噓2(2推 0噓 4→)

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各位大大好，目前在做siRNA transfection的實驗，的是為了要驗證用meta-analysis 找出的基因是可信的。但最近試了幾次不同siRNA的濃度，效果一直不穩定QAQ。 [細胞株]: MCF-7 和 MDA-MB-231 [siRNA]: IDT DsiRNA (27 mer) [transfection reagent]: lipofectamine (invitrogen) [實驗步驟]: (目前是測試siRNA的濃度哪個較好) [測試siRNA濃度為 30nM 20nM 10nM] 使用6 well 來進行實驗，每一個well最後medium體積為 1.5 ml。 {siRNA} 1. 先由 20uM siRNA (stock)取出後加入serum及antibiotic-free medium 做成 300 nM siRNA 靜置5-10分鐘後在序列稀釋成 200 nM 以及 100 nM siRNA (因之後再加入MEDIUM會將siRNA濃度稀釋10倍變成預測試的30,20,10nM) {lipofectamine} 2.做出比例為 5ul lipofectamine in 150ul serum及antibiotic-free medium 的stock (也是有靜置5-10分鐘) {siRNA/lipofectamine} 3.在150ul 300nM, 200nM, 100nM siRNA中各加入transfect reagent 150ul(含5ul lipofectamine) 並靜置25-30分鐘 (此時為300 ul 混和液) {add in 6 well} 4. 將前一天已貼在6 well的cell (滿度7-8成)，將舊的medium(含serum和antibiotic)移除，加入1.2 ml serum&antibiotic-free medium 5. 再將300 ul siRNA-lipofectamine 加入 6. incubate 24h後換回正常medium (10% FBS & antibiotic)再incubate 24h 7.抽RNA 轉cDNA 測qPCR 看transfect基因的表現量變化。 ============================================= 整個實驗流程大致如上，但測出來的結果有時siRNA濃度低的組別，基因表現量比濃度高的低.... 不曉得是不是上述步驟那些不妥(因實驗室沒人做過，而我本身大學也不是生物背景) 另外有看到有人說transfection前不可以換medium，不曉得是不是就是我的步驟QQ 請各位大大幫忙QAQ 這部分測完要在後續做cell migration & invasion的實驗..... 謝謝>"< -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.248.206.128 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1424503802.A.34D.html ※ 編輯: swoopsky (111.248.206.128), 02/21/2015 15:32:25