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[求救] transfer後殘留在蠻多在膠上

看板Biotech (生命科學)作者 (有人試我的密碼，幹)時間10年前 (2015/03/15 00:04), 10年前編輯推噓2(2推 0噓 9→)
留言11則, 7人參與, 最新討論串1/1
濕式tranfer buffer: Tris-glycine-methanol Tris: 3.03g glycine: 14.4g methanol 200ml 補水到1L 10% SDS-PAGE, load 20ug protein tranfer 條件：定30V 大約9x~11x mA, 16hr, 然後調到定60V, 29x mA 3hr 在4度C cold room result: http://ppt.cc/Bkex PonceauS 可以看到100kDa以上高分子量的都看太不到 但我的western blotting不需要管那部分... 不過就是搞不懂為何會殘留這麼多... http://ppt.cc/MvSB commassie blue發現不管高低分子量都有殘留 我是抽membrane /cytosolic fraction 先用低張的tris磨和脹破組織細胞，然後用1% triton x-100, 十萬轉收membrane fraction 不過我的western blotting還是可以壓的到訊號...似乎也沒太大的影響 還是我該加個0.01% 的SDS到tranfer buffer中呢？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.109.220.139 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1426349063.A.205.html ※ 編輯: pent (140.109.220.139), 03/15/2015 00:11:50
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03/15 01:15, , 1F
我看不出condition有明顯問題,但覺得奇怪的是為何ponceau
03/15 01:15, 1F
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03/15 01:17, , 2F
上比marker還顯著的band,卻沒有在CHB上看到殘留?
03/15 01:17, 2F
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03/15 01:21, , 3F
修正,是"marker的band還比較顯著,卻..."
03/15 01:21, 3F
推
03/15 02:11, , 4F
transfer時間好久喔@@
03/15 02:11, 4F
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03/15 17:25, , 5F
transfer 100v 1hr 4度，效果應該不錯
03/15 17:25, 5F
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03/15 19:30, , 6F
上面這個condition用在10%膠,150kda以上的很難不殘留
03/15 19:30, 6F
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03/15 23:42, , 7F
為什麼要要run這麼久阿？有什麼原因嗎？
03/15 23:42, 7F
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03/16 01:25, , 8F
可能是想轉的效果好吧！試看看高電壓，短時間！
03/16 01:25, 8F
推
04/09 01:38, , 9F
我都100~120V隨意 60~80min 5度
04/09 01:38, 9F
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04/09 01:40, , 10F
transfer buffer加1ml SDS 10% 染CBR可以到只剩180kDa up
04/09 01:40, 10F
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04/15 22:22, , 11F
請問樓上，buffer裡有methanol嘛？
04/15 22:22, 11F
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