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[求救] stable clone建立

看板Biotech (生命科學)作者 (TATA box)時間10年前 (2015/03/22 22:43), 10年前編輯推噓5(5推 0噓 22→)
留言27則, 6人參與, 最新討論串1/1
各位版友們好 老闆要求我在小鼠小腸上皮細胞的cell line中 用transfect方式來overexpress我要看的protein 老闆教的方法是: 1.transfect 24hr 後 分成6盤並加入puromycin 2ug/ml(已確定濃度殺的死 2.selection 約2周 3.直到可用肉眼從10cm plate 底下看到細胞團時 用3~4ul的trypsin 把該細胞團上下pipeting吸起來 轉移至24well 中 (這個細胞不容易長成一大坨疊起來 會聚成一片 所以pipet時蠻容易吸到旁邊的colony 4.養到6 well後 收lysate與做stock 此時的western結果都清楚的 會有一個很強的band 問題來了 當我重新thaw out這些cell stock時，會持續養在1ug/ml的puro-DMEM中 (老闆跟學長說可以 但養了幾代後 我的western表現量就越來越低了 之後就沒表現了... 於是做了limit dilution 終於拿到有表現的細胞(只有1個clone 而且目前養了2~3個月都沒有掉 做growth curve結果是 overexpress這個protein會讓細胞長的比較慢 由於只有一個clone 老闆希望可以duplicate 因此我又重新transfect 要挑stable clone 結果還是一樣....thaw out後養了幾代western就沒看到表現了 而且幾乎是0表現 所以limit dilution(正在做 但不太覺得養得出有表現的) 老闆一直覺得是我lysis buffer配錯導致protein lysis不出來 我從NP-40-->TX 100--> RIPA(NP40+DOC+SDS)一直換 他覺得我lysis buffer由於另外加了inhibtor 所以NP40濃度會從1%--->0.95% 導致protein lysis 不出來 而我自己是覺得 會不會我挑single colony時 本來就不是single來源 而且有表現蛋白的細胞又長比較慢 所以就慢慢被埋沒了 為了建立這個stable clone 半年都快過去了 看著同學的data一直生 自己卻一直卡在這裡 有點崩潰阿... 有沒有什麼挑stable clone的建議呢? 是該在最前面transfect後 直接做limit dilution 以確保clone是單一來源嗎? 還是有其他建議 謝謝QQ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 123.194.138.71 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1427035407.A.713.html
推
03/22 23:17, , 1F
如果那麼確定該蛋白oe會影響細胞生理 怎麼不改誘導
03/22 23:17, 1F
→
03/22 23:17, , 2F
型表現呢
03/22 23:17, 2F
推
03/22 23:58, , 3F
1%換成0.95%就會lyse不了...是不是你老闆在搞你啊
03/22 23:58, 3F
推
03/23 00:00, , 4F
protein lysate跑其他蛋白 例如internal ctrl呢 有嗎?
03/23 00:00, 4F
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03/23 00:01, , 5F
如果有那就不會是lysis不完全阿
03/23 00:01, 5F
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03/23 00:01, , 6F
stable clone常常會跑掉 特別是凍了以後 我有做過transf
03/23 00:01, 6F
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03/23 00:02, , 7F
-ect後凍起來就會死掉的細胞... 不行就建議密集把實驗做
03/23 00:02, 7F
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03/23 00:02, , 8F
完不要仰賴凍起來的stock吧
03/23 00:02, 8F
to T大：我有想過但沒跟老闆提 他應該會說：“沒這個必要吧？” 是說induced的有什麼好處嗎？ to A大:我的細胞STOCK後不會什麼死 (超會長) 但表現真的會大下降 因為實驗室只有我一個人在用這種細胞 所以問誰都不知道 我試試看細胞一直養到實驗做完吧 (前提老闆要同意... 另外internal ctrl很正常 我去lyse 之前LD挑出來的clone表現也正常 是新挑的都不表現了 所以我覺得不關lysis bfr的事... 但老闆就要我一直重跑western (ry ※ 編輯: tynse71864 (123.194.138.71), 03/23/2015 01:19:05
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03/23 09:01, , 9F
用lysis buffer的理由好像有點瞎?
03/23 09:01, 9F
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03/23 09:04, , 10F
如果要重挑,在puro接近穩定之後種到極稀釋,就不會難挑了
03/23 09:04, 10F
是puro篩個10天左右 繼續用原來的plate 種到很稀； 還是改種96well呢？ ※ 編輯: tynse71864 (42.66.40.126), 03/23/2015 11:25:14
推
03/23 14:26, , 11F
lysis buffer理由超瞎所以完全不想理
03/23 14:26, 11F
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03/23 14:26, , 12F
如果你要繼續挑的話看要不要增加一點puro的量
03/23 14:26, 12F
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03/23 14:27, , 13F
接著因為細胞特性的關係不要養到肉眼可見
03/23 14:27, 13F
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03/23 14:28, , 14F
顯微鏡下可看到一團形成時用glass cylinder挑
03/23 14:28, 14F
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03/23 14:30, , 15F
至於會不會碰到其他的colony...transfection後分稀
03/23 14:30, 15F
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03/23 14:30, , 16F
一點讓各colony距離大一點
03/23 14:30, 16F
※ 編輯: tynse71864 (42.66.40.126), 03/23/2015 16:14:10
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03/24 17:20, , 17F
若没有 glass cylinder，可以自已切 tip 的頭……另外，可以
03/24 17:20, 17F
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03/24 17:21, , 18F
削尖 tip 尖端用來挑起 colony。
03/24 17:21, 18F
推
03/26 22:46, , 19F
比較建議解凍後先用較高濃度的puro，穩定後再調低。如果
03/26 22:46, 19F
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03/26 22:46, , 20F
繼續被老師懷疑lysis buffer，你就sonication給他看，不
03/26 22:46, 20F
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03/26 22:46, , 21F
相信protein沒有出來 = =
03/26 22:46, 21F
to 塔芭莎大(?) 跟ice大: 這樣的話我應該就要在非hood下進行挑細胞了耶 這樣好嗎 (因為曾經長fungus過...) 我在想想有沒有折衷的辦法 其實會用固定濃度PURO去篩 其一是我之前測試過該濃度可殺死 其二是我拿到的Vector 建議transfect selection就是該濃度 所以我一直沒有去調puro 的濃度 我lysis細胞會vortex 5次耶XD 所以該出來的應該都出來了(吧 不然就是degrade光了... ※ 編輯: tynse71864 (123.194.138.71), 03/26/2015 23:13:45
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03/27 13:20, , 22F
不是肉眼可見嗎？ 在顯微鏡下先在dish背面點一下相對位置，
03/27 13:20, 22F
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03/27 13:21, , 23F
再回到 hood 中操作啊。
03/27 13:21, 23F
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03/27 13:22, , 24F
肉眼可見的 colony 中雖然可能還有一部分
03/27 13:22, 24F
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03/27 13:24, , 25F
可能含有還未死透的細胞，但比一開使用trypsin沖刷的強一點
03/27 13:24, 25F
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04/09 01:30, , 26F
跑看看PCR,會不會只有在基因上只有差異，蛋白不太明顯
04/09 01:30, 26F
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04/09 01:30, , 27F
！？
04/09 01:30, 27F
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