[求救] cDNA取量問題(Realtime PCR)

看板Biotech (生命科學)作者 (徵5/2 獅象戰內野優待票)時間10年前 (2015/04/20 11:23), 編輯推噓5(5015)
留言20則, 9人參與, 最新討論串1/1
這問題可能有點基礎 不過小弟第一次做realtime PCR 因此還是發文請教了... RNA轉cDNA步驟: 假設我有A,B兩個sample A sample: 1ug RNA要取0.38 ul B sample: 1ug RNA要取0.72 ul 轉cDNA的時候我就取A sample 0.38ul和B sample 0.72ul 也就是各取1ug的RNA去轉cDNA 這樣我要上機做Realtime PCR之前 cDNA要再做一次定量嗎? 還是我A sample和B sample的cDNA不用定量,直接取1ul就會取到相同的量? 請版友不吝指教了 謝謝! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 210.60.190.100 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1429500183.A.DA3.html

04/20 11:28, , 1F
我cDNA沒再定量,但跑resl-time PCR時會跑internal control
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04/20 11:28, , 2F
,理論上二樣本所得之值不會差太多
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轉完RT的cDNA很難精準定量
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轉完RT的cDNA通常不會純化,就直接做qPCR,所以不會定量
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沒純化過,定量沒有意義
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有reference就不用定量啦 ... 都是比2-△△CT
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04/20 15:52, , 7F
感謝大家的回覆!
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04/21 01:32, , 8F
cDNA 不用定量?會不會每一體積濃度差很多造成 ref cycl
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e數差很多?
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轉RT時RNA一定會定量啊!!理論上等量RNA轉出來的cDNA量
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這在internal control的Ct值就看得出來,如果差很多
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反而要注意這麼大的誤差是怎麼來的
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等量RNA轉出來的cDNA量應該差不多
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04/21 13:44, , 14F
謝謝樓上 解惑ㄌ
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^了
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04/24 01:59, , 16F
用 pipetman 取 1.0 ul 以下的東西,你覺得這樣會夠精準嗎?
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還不如相信 qPCR 做的 internal control。
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我RNA萃完就會先定量再轉成cDNA
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轉成cDNA後就直接做PCR
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05/02 12:21, , 20F
不用再定量一次
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文章代碼(AID): #1LD74NsZ (Biotech)
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