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[求救] Supercoil form plasmid 電泳問題

看板Biotech (生命科學)作者 (打狗)時間10年前 (2015/04/24 17:31), 10年前編輯推噓1(1推 0噓 48→)
留言49則, 5人參與, 最新討論串1/1
大家好 ，最近接了一個案子 要跑supercoil DNA plasmid電泳 分成 直接 loading plasmid （supercoil form） enzyme digest成為open-circular form enzyme digest成linear form 根據datasheet SC跑最下面 ，OC較高 ，LC略比OC高 可是我跑出來 ，SC,OC沒問題 但LC卻比SC還低 另外包括marker,band都不清楚 但很粗 ，所以應該不是loading量問題 可能在於染色 ， 是用EtBr代染劑染的 聽說用不同染劑可能會因此跑出不同大小？？ 匯整問道為： 1. LC位置過低可能造成因素 2. band不明顯是染劑問題？（如果跑膠時間很長會有影響嗎） 3. 不同染劑可能造成位置差異？ 4. supercoil marker位置與1 kb marker 完全不同 ，該相信誰 謝謝各位 -- Sent from my Android -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 202.169.162.4 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1429867913.A.A99.html
推
04/24 17:50, , 1F
切位只有單切嗎? 另外把sc取一些用力pippette
04/24 17:50, 1F
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04/24 17:51, , 2F
外力動能應該就能造成oc了
04/24 17:51, 2F
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04/24 18:04, , 3F
OC是用enzyme單切一股沒錯 ，是nick
04/24 18:04, 3F
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04/24 22:09, , 4F
我用一般的safe dye的確跟EtBr會有不同
04/24 22:09, 4F
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04/24 22:12, , 5F
只是你有放ref? 怎麼知道是OC比SC低,還是SCOCLC都變低?
04/24 22:12, 5F
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04/25 09:03, , 6F
外染啊
04/25 09:03, 6F
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04/26 18:07, , 7F
目前打算外染 ，至於高度是有資料的 ，算是有ref
04/26 18:07, 7F
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04/26 19:37, , 8F
既然是SC,就不是以size區別的,光憑高度怎知是SC
04/26 19:37, 8F
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04/26 19:41, , 9F
SCLCOC常以整體分布最下面認定是SC,而不是精確位置吧阿
04/26 19:41, 9F
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04/27 00:16, , 10F
好的 ，因為以前沒接觸過 ，謝謝你
04/27 00:16, 10F
※ 編輯: eric1210 (118.166.153.149), 04/27/2015 00:18:40
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04/27 00:19, , 11F
我發現我打錯字 ，有問題是LC，他比SC還低 ，要再確認
04/27 00:19, 11F
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04/27 20:50, , 12F
LC 是簡寫？那個 C 是打哪兒來的？
04/27 20:50, 12F
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04/27 20:51, , 13F
外染的位置才會正確，你內染了，SC 都很難形成單一相吧？
04/27 20:51, 13F
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04/27 21:00, , 14F
一般外染時，linear form 的位置一定是固定的，絕一可能比SC
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04/27 21:02, , 15F
還低。光看 gel，你要如何確定 linear 比 SC 低？而比 SC 低
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04/27 21:03, , 16F
的就一定是你認為的 linear form?
04/27 21:03, 16F
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04/27 22:18, , 17F
現在外染後 ，linear form還是比SC，因為我沒有map
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04/27 22:18, , 18F
所以不知道是否切兩刀以上 ，其他小片段沒看到了
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04/27 22:20, , 19F
我懷疑溝通不良？ 你如何從multi-band知道哪個是SC?
04/27 22:20, 19F
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04/27 22:20, , 20F
比SC低是在同一塊gel上的相對位置，至於我沒有map
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04/27 22:21, , 21F
所以是參考data sheet的 ，根據data sheet最低的是SC
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04/27 22:22, , 22F
阿 ，是single band,SC OC linear form分別在三個不同la
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ne
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04/27 22:24, , 24F
既然最低的是SC,就不會LF有比SC還低的問題阿
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04/27 22:25, , 25F
SC => 僅loading plasmid. OC=>loading切一個nick的plas
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mid. linear form=> loading 切成linear form的plasmid.
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如果你看到LF比SC還低,就有可能SC不是如你認為的
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04/27 22:26, , 28F
當然,你說的two cut也可能造成上面的困擾就是
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04/27 22:26, , 29F
對 ，可是那是data sheet,我自己跑出來最低的是LF
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04/27 22:28, , 30F
不過當你說僅load p就是SC其實是有問題的,因為SC應該以比
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04/27 22:28, , 31F
LF的結果才能判定,畢竟uncut不必都以SC存在
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04/27 22:30, , 32F
所以一般來說, 如果LF 是one cut,SC會比LF低才對?
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04/27 22:31, , 33F
這方面我真的不了解@@ 抱歉 plasmid是sponsor給的
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所以可能我認為的SC實質上不是SC?
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04/27 22:36, , 35F
因為根據我的了解,SC應該會最快,OC第二,LF最慢
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04/27 22:37, , 36F
data sheet也是如此,但我拿做data的同一管LF來跑
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04/27 22:38, , 37F
結果就是不一樣,自己重新digestion也沒改變
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04/27 22:39, , 38F
也不知道是因為LF有兩個以上cut,還是我電泳問題
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04/27 22:40, , 39F
還是染色問題,還是根本就是SC本身不是SC
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04/27 22:46, , 40F
有查到資料是寫電泳速率 SC>LC>OC 混亂了...
04/27 22:46, 40F
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04/27 23:08, , 41F
我參考的也是SC-LF-OC,所以當疑似的SC比linear還慢,會先懷
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04/27 23:09, , 42F
疑可能不是SC,或是linear有誤,而不會真的認定SC比較高
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04/27 23:18, , 43F
那我先朝SC linear這方面去探討好了,因為map是對方機密
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所以要去看看是不是有two cut可能只能用高%gel跑
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04/27 23:19, , 45F
看有沒有看到其他小片段,SC要如何確認就沒概念了
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04/27 23:19, , 46F
無論如何還是謝謝你
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04/28 01:22, , 47F
基本上，plasmid 不是自己 prepared，我都深深懷疑其完整性.
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04/28 01:23, , 48F
過程中很容易形成一堆OC。map是機密，那跑膠圖應該不是吧？
04/28 01:23, 48F
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04/28 01:24, , 49F
可以秀一下比較圖嗎？
04/28 01:24, 49F
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