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[求救] western blot位置不對

看板Biotech (生命科學)作者 (daffinger)時間10年前 (2015/05/20 00:01), 編輯推噓2(2推 0噓 16→)
留言18則, 5人參與, 最新討論串1/1
最近做western,好不容易終於看到band了 但是發現跟網頁上的位置不同 網頁上大概55Kd，我的大概落在40Kd control組跟treatment組都一樣(所以應該不是因為加藥造成修飾的問題) band很明顯也沒有雜band 請問是蛋白質degraded嗎?(加sample buffer煮5min，冰-80度) 還是煮蛋白的溫度太高(大概有95度以上，根據別人的方式)? RIPA的反應時間太久會這樣嗎?(4度放了有一個小時) 有爬文說marker不一定準，要看loading control (是這樣嗎?) 新手發問，請多見諒 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 42.71.81.121 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1432051283.A.6B9.html
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05/20 00:27, , 1F
現在多數公司的抗體sheet有一定比例的size是錯的
05/20 00:27, 1F
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05/20 00:30, , 2F
請用genecard等網站查詢物種標準MW或再si等以確認位置較好
05/20 00:30, 2F
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05/20 00:31, , 3F
isoform (tissue-spicific)?
05/20 00:31, 3F
推
05/20 13:18, , 4F
datasheet不要太過相信 各種modification, isoform,
05/20 13:18, 4F
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05/20 13:19, , 5F
conformation, dimer等 都有可能出現位置不符
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05/20 13:56, , 6F
marker 和 SDS-PAGE 濃度也會影響判斷。
05/20 13:56, 6F
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05/20 13:57, , 7F
還有 protein 有没有被修飾也會是位置不同的原因之一。
05/20 13:57, 7F
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05/20 14:11, , 8F
實驗技術上的錯誤是可以接受的,位置不同的解釋,abcam每支
05/20 14:11, 8F
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05/20 14:12, , 9F
發現gapdh也大概差10Kd左右，請問marker會有問題嗎?
05/20 14:12, 9F
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05/20 14:14, , 10F
目錄也都有位置非預期的解釋,但其實不少問題是各家公司自
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05/20 14:16, , 11F
行剪貼別家OEM的產品,把含tag訊息移除等,非實驗的錯誤
05/20 14:16, 11F
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05/20 14:17, , 12F
原po會不會是prestained都是藍色,整個marker位置都錯估
05/20 14:17, 12F
推
05/20 14:39, , 13F
marker用兩個牌子平行一起跑看看吧
05/20 14:39, 13F
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05/20 14:41, , 14F
我的經驗是 marker不準也不會差太多 特別是你的size也還
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05/20 14:41, , 15F
在常見range之內 過大或過小的band MW比較容易差的大
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05/20 17:13, , 16F
你把圖放上來看看吧。另外，可以詳加說明實驗條件嗎？
05/20 17:13, 16F
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05/20 18:05, , 17F
謝謝大家，我下次先換一個marker試試看
05/20 18:05, 17F
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05/24 23:10, , 18F
我前兩天 害我剪到band
05/24 23:10, 18F
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