PTT職涯區 / Biotech (生命科學)

[求救] pcDNA3.1(+)stable clone建立

看板Biotech (生命科學)作者 (欣承男孩)時間9年前 (2015/06/11 13:32), 編輯推噓14(14推 0噓 53→)
留言67則, 10人參與, 最新討論串1/1
各位版友大大們好 最近小弟的實驗要開始建立以pcDNA3.1(+)為載體的Stable clone MCF7細胞株 建立的方式參考學長姐的實驗記錄以及pcDNA3.1(+)的產品資訊 主要的方法是先把pcDNA3.1(+) transfect到MCF7細胞之後 隔24小時後有收一些細胞下來觀察transfection有無成功 然後剩下的細胞則是繼續培養在含有抗生素G418的medium中 來篩出stable clone出來 每2天要換一次medium 大約要篩2週 G418最後在細胞中的濃度是1ug/ml(此濃度是參考畢業學長姐的論文) 根據RNA定量的結果證實transfection是有成功的 但是剩下來培養在含G418的細胞卻發生以下的現象: 1.一開始剛加G418的時候好好的，隔天看細胞發現細胞有凋亡大約5成，再隔天看 發現細胞凋亡大約到7成了...(存活下來的細胞只剩3成) 2.後來我換了一次medium，重新加入G418，隔天再看一次細胞，發現已經凋亡了約9成 ，再隔天看一次細胞，發現存活下來的細胞屈指可數...... 想要問版友大大們這樣的現象是正常的嗎? 我的理解是加入G418最主要的目的是為了要殺掉沒有被成功transfect的細胞 讓有成功transfect的細胞存活下來 但是今天我的細胞再加入G418後幾乎都死光光了 可是從RNA定量的結果來看我pcDNA3.1(+)應該是有成功送入MCF7才對 所以會不會是以下兩個問題 1.G418加入的濃度過高:加入的濃度條件是我參考學長姊的畢業論文，他們用的plasmid 和細胞都和我一模一樣，所以我想說這個濃度應該是很適當的才對 2.選用的抗生素不恰當:pcDNA3.1(+) vector內包含抗Neomycin的基因，G418是Neomycin 的衍生物，所以我想說應該也不是這個原因才對 拜託了各位大大們 小弟會感激不盡 小弟我好想要趕快畢業阿QQ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.121.119 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1434000758.A.862.html
→
06/11 13:58, , 1F
stable clone是指你送進去的plasmid有插進genome中
06/11 13:58, 1F
→
06/11 13:59, , 2F
數量本來就不會太多了，不會你的細胞我沒使用過所以不知道
06/11 13:59, 2F
→
06/11 13:59, , 3F
一般狀況下成功率有多少
06/11 13:59, 3F
→
06/11 14:00, , 4F
而且你一開始送進去後抽RNA轉RT去看結果基本不准
06/11 14:00, 4F
→
06/11 14:01, , 5F
即使有處理DNaseI還是有很高機會去P到plasmid
06/11 14:01, 5F
→
06/11 14:04, , 6F
要確認的話我們實驗室一般是用western或是co-transfect
06/11 14:04, 6F
→
06/11 14:04, , 7F
GFP plasmid
06/11 14:04, 7F
→
06/11 14:05, , 8F
細胞有亮基本上就表示有transfect成功，但是要變stable
06/11 14:05, 8F
→
06/11 14:06, , 9F
還是會因為細胞不同成功率會差很多
06/11 14:06, 9F
推
06/11 14:48, , 10F
G418的使用濃度你可以先用96孔盤來測試，
06/11 14:48, 10F
→
06/11 14:49, , 11F
找到lethal concentration再往下調100~200 ng/ml
06/11 14:49, 11F
→
06/11 14:49, , 12F
有時候這些東西在不同人手上就是不一樣，玄玄der
06/11 14:49, 12F
推
06/11 18:50, , 13F
用G418 ok
06/11 18:50, 13F
→
06/11 19:22, , 14F
你把transfection成功當做是stable candidate了,其實差異
06/11 19:22, 14F
→
06/11 19:24, , 15F
很大,如果G418加了不會死,那當初就不需特別用G418篩了阿
06/11 19:24, 15F
→
06/11 19:29, , 16F
你這裡的G418不只是殺"沒有被transfect"的細胞,而是要殺
06/11 19:29, 16F
→
06/11 19:31, , 17F
non-integrated"的細胞,所以才會被稱為stable clone
06/11 19:31, 17F
推
06/11 20:30, , 18F
私以為stable clone 至少是一個月的事？需要讓時間
06/11 20:30, 18F
→
06/11 20:30, , 19F
把transient， not-so-stable 跟stable clone區分開
06/11 20:30, 19F
→
06/11 20:30, , 20F
來
06/11 20:30, 20F
→
06/12 08:51, , 21F
你的問題2很嚴重啊。我覺得有些東西你不弄清楚，還是緩點畢
06/12 08:51, 21F
→
06/12 08:55, , 22F
業的好。 ps. 一個是 phosphotransferase 一個是antibiotic
06/12 08:55, 22F
→
06/12 08:57, , 23F
嘖！抱歉，我眼殘了。自打臉～～
06/12 08:57, 23F
→
06/12 09:02, , 24F
我個人是覺得你transfection可能並没有你想像來得高。一是用
06/12 09:02, 24F
→
06/12 09:03, , 25F
a90648網友說了的，你測試的手段太單一，而且可信度可能不大
06/12 09:03, 25F
→
06/12 09:04, , 26F
二是你的control組的死亡率如何？我猜也和你的實驗組一樣的
06/12 09:04, 26F
→
06/12 09:05, , 27F
速度。這樣可能問題並不在selection本身，而是細胞有問題。
06/12 09:05, 27F
→
06/12 09:06, , 28F
而且，用1ug/ml 來篩選，壓力太小了，如果tranfect成功，不
06/12 09:06, 28F
→
06/12 09:07, , 29F
太可能一開死就死一大票。1ug/ml比較像是maintain時的濃度。
06/12 09:07, 29F
→
06/12 10:18, , 30F
我猜是寫錯了,應該是1mg/ml,就算maintain也至少要50ug/ml
06/12 10:18, 30F
→
06/12 10:19, , 31F
我們MCF7用的是300-500ug/ml這個範圍
06/12 10:19, 31F
推
06/12 12:21, , 32F
質體的品質ok嗎？濃度有跑膠確定嗎？有時機器測不準
06/12 12:21, 32F
推
06/13 01:38, , 33F
推樓上~若質體supercoil的比例低, transfect的比例會大降
06/13 01:38, 33F
→
06/13 01:39, , 34F
若表現的是原先MCF7沒有的基因, 跑QPCR會很明顯
06/13 01:39, 34F
推
06/13 01:43, , 35F
即使只有少數的細胞有表現
06/13 01:43, 35F
推
06/13 01:48, , 36F
可以1.test transfection condition (拿個表現GFP的質體)
06/13 01:48, 36F
→
06/13 01:52, , 37F
2.同M大 檢查質體quality(100ng 跑個1% agarose gel)
06/13 01:52, 37F
→
06/13 01:55, , 38F
3. 正在select的MCF7如果還沒死光, 就繼續篩(大概2-4周)
06/13 01:55, 38F
→
06/13 10:48, , 39F
其實沒必要探討supercoil與test condition,stable不講求這
06/13 10:48, 39F
→
06/13 10:50, , 40F
些,而是integration,所以才有linearized plasmid for
06/13 10:50, 40F
→
06/13 10:55, , 41F
stable transfection的嘗試;transfect再好細胞也是死一堆
06/13 10:55, 41F
推
06/14 00:17, , 42F
transfection效率高integration 也會比較高吧?
06/14 00:17, 42F
推
06/14 01:02, , 43F
跑膠看supercoil的比例只是要驗證這管plasmid的品質,
06/14 01:02, 43F
→
06/14 01:03, , 44F
排除gDNA,RNA汙染外,一般來說supercoil比例應該最高
06/14 01:03, 44F
→
06/14 01:03, , 45F
比例低則可能已經產生nicked form 並不適合transfection
06/14 01:03, 45F
→
06/14 01:04, , 46F
B大提到的linearized plasmid是會增加integration沒錯
06/14 01:04, 46F
→
06/14 01:04, , 47F
但前提是plasmid DNA 品質好的條件下.
06/14 01:04, 47F
推
06/14 01:21, , 48F
除了plasmid品質外,我想transfection condition也蠻重要
06/14 01:21, 48F
→
06/14 01:21, , 49F
照原PO的結果來看, 推測transfection效率可能不佳,
06/14 01:21, 49F
→
06/14 01:22, , 50F
導致細胞一下子就死光,幾乎沒有細胞撐過transient stage
06/14 01:22, 50F
→
06/14 01:22, , 51F
更別說integrate到gemone的比例又更少了...
06/14 01:22, 51F
→
06/14 01:24, , 52F
不過我有點好奇, 原PO該不會加到puromycin了吧...
06/14 01:24, 52F
→
06/14 01:24, , 53F
以上只是個人看法, 有錯還請指教(抖~)
06/14 01:24, 53F
推
06/14 12:07, , 54F
是說 送進去的是單純的vector嗎 還是有其他的表現pr
06/14 12:07, 54F
推
06/14 12:09, , 55F
protein
06/14 12:09, 55F
→
06/14 12:10, , 56F
我之前做tf (用puro）最後大概剩一成吧 還是能挑
06/14 12:10, 56F
→
06/15 10:22, , 57F
我確定我是加G418 然後篩選濃度我打錯了 是1000ug/ml
06/15 10:22, 57F
→
06/15 10:24, , 58F
然後我送入空的vector或是有insert外來序列的vector
06/15 10:24, 58F
→
06/15 10:26, , 59F
一樣在加入G418之後幾乎是死光的狀態 我覺得有可能是
06/15 10:26, 59F
→
06/15 10:28, , 60F
我transfection的過程就沒有成功 plasmid的品質我會
06/15 10:28, 60F
→
06/15 10:29, , 61F
跑膠去測試 謝謝各位大大們的建議 小弟感激萬分
06/15 10:29, 61F
→
06/15 21:43, , 62F
呃，你應該也要有個没transfect的純細胞當對照吧？
06/15 21:43, 62F
推
06/17 20:55, , 63F
有篇Lonza stable clone的protocol可以參考~
06/17 20:55, 63F
推
07/23 16:01, , 64F
1mg/ul可能太強了 還是先titrate濃度再看看吧 而且有些
07/23 16:01, 64F
→
07/23 16:02, , 65F
時候是transfect完後先多養兩天再開始Selection 讓他有
07/23 16:02, 65F
→
07/23 16:02, , 66F
點時間表現resistant gene 否則即使有transfect進去也會
07/23 16:02, 66F
→
07/23 16:03, , 67F
被你掛掉 至於integrated與否 應該是selection後期的事
07/23 16:03, 67F
‣ 更多 shinchenboy 的文章
文章代碼(AID): #1LUHrsXY (Biotech)
Biotech 近期熱門文章
更多 近期熱門文章 >>
PTT職涯區 即時熱門文章
更多 即時熱門文章 >>
‣ 更多 shinchenboy 的文章
文章代碼(AID): #1LUHrsXY (Biotech)