[求救] 關於自製ELISA standard濃度過低的問題

看板Biotech (生命科學)作者ararthur時間9年前 (2015/11/12 14:13)推噓0(0推 0噓 10→)

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各位好，目前接了一個實驗是設計一個indirect competition ELISA 手上有的東西: 1. human X full-length recombinant protein (欲測蛋白, 非所使用一抗的immunogen) 2. anti-human X mouse monoclonal antibody (Primary Ab, immunogen為另一來源的full-length X protein, unknown epitope) 3. anti-mouse IgG1 rabbit antibody (Secondary Ab) 4. Human serum sample 5. Human plasma sample == || ELISA策略是：||-X <-1Ab-2Ab*HRP || AG-> 先將antigen X coating在ELISA用96-well，blocking，加入待測物AG 與序列稀釋的X (as standards)，再加入Primary Ab, Secondary Ab, TMB substrate, stop, Count OD at 450nm by ELISA reader. 如若加入的sample會搶走Primary Ab, 則結合在solid phase的X 就會得到比較少的Primary Ab與後續反應的呈色。 ([AG]↑，則 OD↓) == 實驗設計之初，我titrate primary Ab 與 coating Ag, 得到這個結果 http://0rz.tw/h1S3k (Excel表單，第一個工作表)，由此表得知coating Ag在250ng/ml時 OD值 Max-min的range最大，而Primary Ab則在4000x dilution時 OD值 Max-min的range最大，所以我初步設定coating Ag = 250ng/ml, primary Ab = 4000x dilution. 接著我使用此condition測不同稀釋倍數的human serum sample，雖然測試點位不多，但也能明顯看到OD隨著濃度上升而下降 http://0rz.tw/h1S3k (第二個工作表) 未稀釋的plasma組 (OD=0.29) 與未加sample的blank組 (OD=2.24) OD值差距可以拉到將近2.0; 然而我如果使用序列稀釋的 X recombinant protein當作standards 從濃度 3333ng/ml 兩倍序列稀釋， http://0rz.tw/h1S3k (第三個工作表) 即使加入最高濃度standard, OD值仍然有1.62之高，降不太下來，與沒有加的blank組 (OD=2.24) 比較起來只相差0.6不到... 而低濃度standard的組別，也幾乎就在2.1上下徘徊，與blank組也相差無幾，等於可測得濃度的sample range相當小，運用在不同來源的sample時會窒礙難行。我下一步可能會把standard的最高濃度再上調，試試看是否能夠畫出range比較大的curve, 只是相對於其他commercial ELISA kit的standard大多落在 1000pg/ml~100ng/ml, 我所設定的standard濃度已經算是相當高，再濃下去我的recombinant protein用量與開銷就得突破天際了... === 基於以上遇到的狀況，有幾個問題想請教大家： 1. 除了繼續加大standard用量以外，我應該如何調整實驗condition, 才能把standard濃度拉低 curve仍能維持呢？ 2. 這樣的問題是由於standard對coating Ag的競爭性太弱所導致嗎？可是兩者我都是使用同一種recombinant protein去作，對打濃度也達到3333ng/ml vs 250ng/ml了，怎麼3333ng/ml 搶primary Ab 還是搶不過 250ng/ml的呢？ 3. 另外有一種有別於competition ELISA的 inhibition ELISA, 是把protein先與primary antibody incubate之後，再加入well與coating Ag反應呈色，但我不大了解這樣做的原因，所測的目標是coated protein嗎？以上，謝謝看完繁雜的文章，有任何看不懂的地方也請告知，我會再作更仔細的說明，感激。台灣隊十二強加油！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.121.122 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1447308782.A.4C8.html ※ 編輯: ararthur (140.112.121.122), 11/12/2015 14:16:04 ※ 編輯: ararthur (140.112.121.122), 11/12/2015 14:16:48 ※ 編輯: ararthur (140.112.121.122), 11/12/2015 14:17:44 ※ 編輯: ararthur (140.112.121.122), 11/12/2015 14:18:51 ※ 編輯: ararthur (140.112.121.122), 11/12/2015 14:23:34