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[求救] 膠體純化的回收率低

看板Biotech (生命科學)作者 (Green)時間9年前 (2015/12/02 02:06), 編輯推噓8(8推 0噓 28→)
留言36則, 11人參與, 最新討論串1/1
最近在做cloing 要將1k左右的片段接到vector上 目前的做法是切10ug的insert 跑膠分離後切下要的片段進行膠體純化 然後我是用GeneMark的kit 目前是一直卡在elute後的O.D值都很低 回溶的體積為25-30ul 但是O.D大概都在20-30ng/ul間 雖然這樣算一算濃度還有將近1ug 但是後續還要進行blunting 表示前面的濃度要高一點 才可以繼續後面的純化... 想請問大家要怎麼提高kit的回收率呀QQ 廠商都標榜回收率將近90% 怎麼我反而是相反= =''' -- Sent from my Android -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 59.127.243.98 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1448993171.A.E4E.html
推
12/02 02:53, , 1F
10ug去切是指total 10ug嗎？如果vector5k，這樣你原始1
12/02 02:53, 1F
→
12/02 02:53, , 2F
0ug切出來完全不lost insert也只有2ug而已
12/02 02:53, 2F
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12/02 07:52, , 3F
膠體純化我覺得用kit很看臉，不同品牌在不同實驗室都有不一
12/02 07:52, 3F
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12/02 07:52, , 4F
樣的效率
12/02 07:52, 4F
推
12/02 09:53, , 5F
量很夠了吧? 你總量要下多少做transformation?
12/02 09:53, 5F
推
12/02 10:04, , 6F
通常vector+insert約1ug 就有clone可以挑了
12/02 10:04, 6F
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12/02 11:26, , 7F
是total取10ug去digestion 然後全下跑膠
12/02 11:26, 7F
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12/02 11:31, , 8F
我是用學姐的純化方法 然後同樣的kit 學姐就說沒純化這
12/02 11:31, 8F
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12/02 11:31, , 9F
麼少= ='''
12/02 11:31, 9F
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12/02 11:36, , 10F
因為後續還要用pfu polymerase做blunting 然後再純化一
12/02 11:36, 10F
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12/02 11:36, , 11F
次 所以擔心目前的濃度不夠(椅稻･`)
12/02 11:36, 11F
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12/02 13:34, , 12F
你沒有回答到1樓問的10ul是哪裡來,這才是關鍵
12/02 13:34, 12F
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12/02 13:35, , 13F
10ug
12/02 13:35, 13F
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12/02 13:38, , 14F
既然可以知道10ug,想必來源不是PCR產物,而是plasmid這類
12/02 13:38, 14F
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12/02 13:40, , 15F
既然如此,直接用pfu從plasmid以PCR放大,這會不會更方便?
12/02 13:40, 15F
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12/02 17:54, , 16F
一塊膠不夠,你怎麼不切兩塊
12/02 17:54, 16F
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12/02 18:10, , 17F
要是你的原始plasmid是9K以上，那切下來是那個量很正常啊。
12/02 18:10, 17F
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12/02 18:13, , 18F
把那一管水份蒸發一下，就會變濃了。你的blunting是用Klenow
12/02 18:13, 18F
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12/02 18:16, , 19F
嗎？對了，片段補平之前，不太建議跑膠純化。
12/02 18:16, 19F
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12/02 18:18, , 20F
還有，你寫到「一直卡」……那表示做了很多吧。可以全弄成同
12/02 18:18, 20F
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12/02 18:19, , 21F
一管再將水蒸發一下，那不就會有更多更濃的insert了？
12/02 18:19, 21F
推
12/03 11:20, , 22F
我覺得20～30ng蠻高的了，我做的insert 1.2kb左右 vect
12/03 11:20, 22F
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12/03 11:20, , 23F
or 5kb左右，都是從膠上萃下來，之後ligation也成功
12/03 11:20, 23F
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12/03 11:21, , 24F
回溶體積32ul
12/03 11:21, 24F
推
12/03 21:54, , 25F
濃度低沒關係 還是丟丟看 ligation 機率好中了就中了
12/03 21:54, 25F
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12/03 21:54, , 26F
xd
12/03 21:54, 26F
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12/03 21:57, , 27F
死馬當活馬醫 ligation最後要求要10ul我30還是有成功
12/03 21:57, 27F
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12/03 21:57, , 28F
xd
12/03 21:57, 28F
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12/03 21:57, , 29F
另外水可以蒸乾或濃縮
12/03 21:57, 29F
推
12/03 22:29, , 30F
廠商給的回收率看看就好了...基本上抽不同大小的片段
12/03 22:29, 30F
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12/03 22:31, , 31F
回收率都部會不太一樣，決定回收的效率主要就是看品牌，
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12/03 22:32, , 32F
如果是品質差的牌子怎麼抽都不會好，再來就看你的目標
12/03 22:32, 32F
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12/03 22:34, , 33F
片段多大，人為的差異...我想就一些小技巧可以彌補吧?
12/03 22:34, 33F
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12/03 22:34, , 34F
但決定性沒有像牌子那麼重要
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推
12/04 01:00, , 35F
大象牌5-7成我覺得差不多
12/04 01:00, 35F
推
12/15 09:17, , 36F
回收少沒關係阿　ligation照作中了就是你的
12/15 09:17, 36F
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