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[求救] cloning做出來但有問題，文有點長

看板Biotech (生命科學)作者 (Lord of Ethanol)時間9年前 (2016/01/23 15:53), 9年前編輯推噓4(4推 0噓 27→)
留言31則, 5人參與, 最新討論串1/1
我將930bp的insert放入47xx bp的vector ligation的產物有放進comptent cell篩選抽出plasmid 後來切一刀跑膠看大小比6000少一點，符合預期 也有跑切了一刀的空vector 分子量比5000少一點，也符合預期 用pcr檢查insert不成功有許多雜band，還在重新嘗試 這個clone的產物我是要接著做bac to bac的實驗，將新plasmid放進DH10bac的comptent cell上，使我的insert被Tn7夾進bacmid中，完成病毒DNA 問題是我放新vector進去後，塗盤都不會長菌，我連藍白篩的步驟都到不了 加入plasmid後有搖SOC medium，菌沒死 代表我的菌可能沒有吃進plasmid，或者就是吃進去沒有發生重組，那這就代表我的plasm id基因是錯的所以不會重組 也有做空的vector，就有長出藍白的菌株 代表空的vector沒問題，菌也沒問題 懷疑transform沒進去，還嘗試兩次heat shock，菌也沒死，但塗盤還是不會長 後來懷疑有重組的菌太少，搖5ml的菌 o/n，然後低速離心，抽取部分上清液，用較濃的菌液塗盤，一樣什麼都沒長 結論是我有做空vector的ctrl，表示手法跟comptent cell跟vector本身是沒問題的，但 我vector跟insert做clone之後就壞了 但是奇怪的是我的clone產物大小正確，也能用通過抗生素篩選，就算我insert出問題，v ector還是原來的DNA序列，重組也應該要發生，做DH10bac的comptent cell也應該要長出 菌 請問各位大大ligation有可能做出產物但DNA序列 mutant掉嗎 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.82.44.202 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1453535589.A.523.html
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01/24 11:54, , 1F
抽了 plasmid 之後有做定序嗎？
01/24 11:54, 1F
定序結果不理想,訊號雜亂,廠商再次嘗試之後表示無法成功定序 但抽出的質體明明很純,濃度也還OK有500ng/ul,我用insert的primer跟vector上的primer 都定不太好...囧,感覺我的vector變了
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01/25 13:14, , 2F
如果你是用傳統方法，用ligase以blunt end的方式黏進去
01/25 13:14, 2F
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01/25 13:15, , 3F
必須考慮合成的primer，5端無phospho group，必須kinase
01/25 13:15, 3F
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01/25 13:15, , 4F
處理過
01/25 13:15, 4F
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01/25 13:16, , 5F
另外，如同一樓，因為你只切一刀，還是以定序為準
01/25 13:16, 5F
我們當初有考慮blunt end會有太多副產物,所以用sticky end來接合 實驗結果是確定接出東西,大小符合,且含有抗生素耐性,也和空vector切一刀比對 排除了vector自接的假訊號 所以儘管定序方面不理想,老闆也認為接出來了,才叫我接著做
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01/26 10:09, , 6F
這個實驗我做過如果有拿到正確的質體，我在heat shock後
01/26 10:09, 6F
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01/26 10:11, , 7F
會放進37度的培養箱內4~5小時培養，促進Tn7幫助質體上的
01/26 10:11, 7F
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01/26 10:12, , 8F
insert進入bacmid中
01/26 10:12, 8F
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01/26 10:13, , 9F
我碩班是學這個，有問題可以寄信給我
01/26 10:13, 9F
Protocol是說heat shock之後用SOC培養4小時,然後第一次失敗了之後我們培養6小時,部分塗盤 剩下的再加SOC繼續放大,濃縮之後再次塗盤,最後不管搖4小時還是6小時,或者之後放大的濃菌 都無法長出任何菌株,有懷疑我置盤跟過程有出錯,但用空vector做ctrl一次就成功 ※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/26/2016 15:43:08
推
01/26 15:29, , 10F
b2b很賭運氣的 不過比b2blue好
01/26 15:29, 10F
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/26/2016 17:15:13
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01/27 09:06, , 11F
你的培養盤上應該含有三種抗生素，理論上heat shock成功
01/27 09:06, 11F
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01/27 09:09, , 12F
不管insert有沒有插入bacmid內都應該會長出菌，空載體在
01/27 09:09, 12F
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01/27 09:10, , 13F
那個環境下是無法長出菌來
01/27 09:10, 13F
有三種抗生素,我看原文protocol的工作原理,應該是pFastbac1這個vector上的T7會夾一段 基因進去bacmid中,而原先pFastbac抗gentamicin的基因序列是反著的,無法抗gentamicin,但是夾入bacmid之後才能正常表達抗gentamicin的基因 原文protocol是說空的pFastbac1 vector在transform進去DH10bac之後,透過T7將一段DNA 夾進去(包含抗gentamicin基因),此時重組完的bacmid才能抗gentamicin,內容提到這是一 個positive control,因為我的vector跟原來vector相比就是多一段我外加的insert而已 具有抗生素耐性的基因還是在vector本身吧,所以空的vector應該要長?因為有轉入抗 gentamicin的基因,而且基因表達方向正確? ※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/27/2016 16:32:16 ※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/27/2016 16:35:04
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01/27 20:00, , 14F
定序沒結果，那有再用PCR確認嗎？可以混用insert和vector上
01/27 20:00, 14F
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01/27 20:00, , 15F
的Primers搭配，另外再尋找其他適合切位做進一步確認。只切
01/27 20:00, 15F
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01/27 20:02, , 16F
一刀，而且是用vector上原有的切位，並不足以說明什麼。應該
01/27 20:02, 16F
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01/27 20:02, , 17F
再行確認你的序列完全沒問題再做下去。賭人品這種事，在科學
01/27 20:02, 17F
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01/27 20:03, , 18F
實驗上經常會得到負值。
01/27 20:03, 18F
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01/27 20:05, , 19F
這家不行換別家，primers可以再訂新的或確認其他因子沒問題.
01/27 20:05, 19F
定序做了一些嘗試都不太行,不是沒訊號就是訊號雜亂,無論從insert端還是vector上, 切一刀的用意不是確定切位,是想讓vector呈線性然後就可以看到正確的分子量大小,因為 supercoil很難看出正確大小 但小弟現在比較不解的是,好就算我放進去的insert是錯的,但我的產物跟原始vector一樣 能抵抗amp,所以vector的序列應該沒錯才對,就只是在切點中插入一段未知的序列,它該有 的vector功能還是應該要存在 畢竟我就是拿那個純的vector切兩刀然後純化在去跟切兩刀的insert進行ligation, 就算我做成vector自接,它也是要具備vector的功能,能轉入bacmid中才對 奇怪的是我就從那個膠切出來怎麼會跑出一個分子量一樣大的vector然後能跟原來vector 一樣能抗其中一種抗生素,但其他部分的基因好像完全不一樣似的,這假訊號也太巧了吧.. 除非接進去的insert上的基因能表達出一些東西破壞其他基因的正常表現... 其實insert在接進去前有定序一次,正確無誤就是了
推
01/28 05:34, , 20F
b2b需要同源重組啦 養菌的timing很難抓 有時候放久一點會
01/28 05:34, 20F
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01/28 05:34, , 21F
中 有時候放久會變弱勢 碰運氣吧
01/28 05:34, 21F
推
01/28 05:38, , 22F
再來就是你的DH10bac是自己再作的還是買i牌貴鬆鬆的 那隻
01/28 05:38, 22F
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01/28 05:38, , 23F
自製的效果很不好
01/28 05:38, 23F
是用i牌貴鬆鬆的,所以前面兩三次沒做出來,老闆就叫我不要做太多嘗試,先找出錯的地方 但用沒接進insert的vector一次就成功...如果接進insert也才多900多bp,轉入bacmid的 效率應該不會因為這900多bp而差太多吧
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01/28 09:25, , 24F
gentamicin 只是確認自己的質體是否有成功進入DH10bac
01/28 09:25, 24F
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01/28 09:28, , 25F
本身DH10bac就應該有Kanamycin和tetracyclin抗生素耐性
01/28 09:28, 25F
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01/28 09:30, , 26F
所以當質體有進去DH10bac中時，有沒有進行基因的轉移都
01/28 09:30, 26F
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01/28 09:32, , 27F
具有三種抗生素的抗性，判斷基因是否插入bacmid中用藍白
01/28 09:32, 27F
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01/28 09:33, , 28F
篩來做判定
01/28 09:33, 28F
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/28/2016 16:09:41
推
02/01 20:51, , 29F
嗯... 看來只能試了 0.,0 DH10bac超貴的 我都減量try
02/01 20:51, 29F
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06/06 16:27, , 30F
定序的總量200-300 ng就可以，你的plasmid濃度500 ng/
06/06 16:27, 30F
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06/06 16:27, , 31F
uL太高了...
06/06 16:27, 31F
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