[求救] Western求救！

看板Biotech (生命科學)作者MLSHBen (酷喔)時間9年前 (2016/08/28 23:52)推噓10(10推 0噓 22→)

留言32則, 8人參與討論串1/1

大家好本板首Po，如有觸犯板規還是甚麼的請盡速通知謝謝最近做Western老是有時候做得出來有時候又做不出來(明明是同一個sample) 做pull down的Western明明沒問題，跑細胞protein的Western卻老是出問題困擾我很久所以想請問大家是不是我哪裡有出問題原本跑出來是這樣http://imgur.com/nxJszRV

或這樣http://imgur.com/aY92h4A

Myogenin和FLAG算是有符合預期但定量不怎麼對所以又跑了好幾次但最近老是跑成像這樣http://imgur.com/tEqoZxd

想請問大家我是不是有哪裡出問題流程列在下面了，想請大家幫我看一下，謝謝！ --------流程開始------- 收cell protein是用1x DPBS wash兩次後加入RIPA buffer (含0.1% SDS, 1x protease inhibitor, 1x phosphotase inhibitor)後用1000 μl的tip刮破細胞後收lysate，4℃ 全速離心半小時後取上清液測OD595算濃度後取50 μg(用二次水或RIPA buffer補到每個sample體積一樣)和4x sample buffer混合 92~95℃煮5分鐘後用100 V跑SDS-PAGE Transfer是使用半乾式transfer 我Transfer前先讓PVDF membrane浸泡在methanol至少1分鐘、厚片濾紙及gel浸泡在1x transfer buffer 先將濾紙放上正極板上，再依序放PVDF membrane、gel、濾紙疊上並擠掉氣泡 (多的transfer buffer用割stacking gel的那個綠色塑膠片塗平在正極板上) 用10 V, 200 mA跑1.5小時 (因為要transfer 2片gel所以用200 mA) 跑完後依marker將預期位置的PVDF割下來放入塑膠盒，用5 % BSA (以1x TBST配置)進行blocking，室溫1小時 1小時後blocking倒掉先加5 % BSA，再加入一抗，4℃ o/n 隔天再拿出來室溫1小時 (學長說有的抗體還需要這步驟讓其binding更好還是啥的) 用1x TBST wash 3次，每次10分鐘倒掉1x TBST後先加入1x TBST，再加二抗，室溫1小時再用1x TBST wash 3~4次，每次10分鐘 PVDF放擦手紙上使其稍微乾一點後用配好的ECL反覆淋5次以上放擦手紙上使其稍微乾一點後放到底片夾的透明膜裡去暗房壓片 -------流程結束------- 其實我個人猜想是不是transfer出問題，但問學長他不認為是transfer的問題關於transfer另一位學長說只需要定電流即可(一片gel用90 mA for 2 hrs，兩片則電流加倍以此類推)，他說因為電壓會隨buffer加的量而有所不同我只定電流幾乎做不出像上面第一張圖或第二張圖那樣 (但pull down我只定電流都沒問題，有觀察到只定電流電壓會升到10~15 V) 帶我做實驗的學長卻連電壓一起定，每次我都有觀察到電壓一到10 V後電流就開始往下掉，但他說電壓有到就好了，有時候這樣就做得出來我看網路上教學影片還有看到把正極板上的buffer吸乾而不是像我們這樣塗平的，然後他是定電壓想請問半乾式transfer到底哪個做法才對？ blocking用BSA或脫脂奶粉好像也沒影響另外想請問抗體是否也可能影響結果？像我問學長FLAG是否可用mouse monoclonal的FLAG一抗，他都叫我用rabbit polyclonal的FLAG一抗雖然我覺得做不出來大概還是我技術的原因居多...... ------------------------- 附上buffer成分 10x running buffer:30.3 g Tris base, 144 g Glycine, 10 g SDS,用二次水配成1L 1x running buffer就是將10x的用二次水10倍稀釋 10x transfer buffer:30.3 g Tris base, 144 g Glycine,用二次水配成1L 1x transfer buffer就是取50 ml 10x，加二次水到450 ml後再加50 ml methanol再混勻，平常存4℃ 10x TBST:40 g NaCl, 12.1g Tris base, 5 ml Tween20,用二次水配成500 ml, pH 7.6 1x TBST就是將10x的用二次水10倍稀釋 4x sample buffer:10 ml的 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), 1.6 g SDS, 8 ml 100% Glycerol, 80 mg Bromophenol blue, 1.6 ml β-me 平常存在-20，分裝1 ml，要用時將那1 ml放室溫等它融後再使用 -------------------------- ps.做膠參照類似這張表http://imgur.com/IMtaj8x

做8 % gel跑FLAG，10 %跑Myogenin 如提供資訊不足請再通知謝謝！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.248.103.200 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1472399550.A.C43.html

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xxtomnyxx

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