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[求救] internal control band粗度差很多

看板Biotech (生命科學)作者 (弦)時間8年前 (2017/02/23 13:05), 8年前編輯推噓6(6推 0噓 18→)
留言24則, 6人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
抽活體組織蛋白質，也用BCA測濃度，但是每次跑western的internal control都不是一樣 粗 我是做不同發育時間點的該組織表現量，然而每次都是發育早期的兩三個時間點internal c 我用的control是B-actin 補充一點，因為被這個問題困擾很久，有測過用lysis buffer稀釋sample和用ddH2O稀釋s am 我的sample是WT，沒有任何處理 請問這個問題要怎麼解決？？？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.4.206 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1487826331.A.DF3.html
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02/23 13:28, , 1F
換一個internal 試看看
02/23 13:28, 1F
推
02/23 16:34, , 2F
簡單敘述一下從抽蛋白質到跑Western前的Sample處理?
02/23 16:34, 2F
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02/23 16:35, , 3F
這樣大家比較好幫你看看是不是哪裡有問題?
02/23 16:35, 3F
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02/23 22:11, , 4F
data永遠是對的
02/23 22:11, 4F
蛋白質是用lysis buffer抽的，proteinase inhibitor都是現加，抽完放冰上十分鐘，4 度C 測濃度是將蛋白質用lysis buffer(現在改用ddH2O)做25倍稀釋，然後用BCA的kit測，根 據? western的步驟我也說一下：每一個well load 80ug的蛋白質+10uL深藍色臭臭的buffer， 膠 真的不知道差異是哪一步造成的，已經做了好多組都是這樣，而且sample算珍貴，如果換 in ※ 編輯: helen82323 (118.160.92.128), 02/24/2017 00:46:24
推
02/24 02:11, , 5F
internal 雖然是穩定表現，但在某些極端條件下還是會跑掉
02/24 02:11, 5F
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02/24 02:12, , 6F
先確定不是internal表現跑掉的問題吧
02/24 02:12, 6F
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02/24 02:12, , 7F
如果是就一定要換了
02/24 02:12, 7F
推
02/24 11:00, , 8F
在發育時間較晚的sample 因其他非actin蛋白產量變多了
02/24 11:00, 8F
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02/24 11:00, , 9F
所以測濃度loading等量蛋白跑膠後 actin比較淡(佔比少)
02/24 11:00, 9F
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02/24 11:00, , 10F
不是正常嗎? 純粹我的猜想
02/24 11:00, 10F
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02/25 02:21, , 11F
.....如果是本身actin在前後期會改變表現量那就代表actin在
02/25 02:21, 11F
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02/25 02:21, , 12F
這裡是不能當作internal即使你硬是自己亂調，得到的結果也是
02/25 02:21, 12F
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02/25 02:21, , 13F
假的，還在那裡糾結全部重做？
02/25 02:21, 13F
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02/25 02:22, , 14F
已經好聲好氣的說了，如果你不聽也沒人會想理你
02/25 02:22, 14F
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02/25 02:25, , 15F
若是每次做的結果actin都是在某個時間點增加/減少，那你第一
02/25 02:25, 15F
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02/25 02:25, , 16F
件事情必須是確認actin的表現量跟其他常見非細胞骨架的inter
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02/25 02:25, , 17F
nal做比較，去確定actin是否為穩定的internal
02/25 02:25, 17F
推
02/25 07:47, , 18F
不同發育階段的internal control表現不一樣很正常...
02/25 07:47, 18F
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02/25 07:48, , 19F
如果你是要量化 試試用ponceau然後用整行(total loading)
02/25 07:48, 19F
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02/25 07:48, , 20F
去normalize
02/25 07:48, 20F
推
02/25 19:54, , 21F
他都先用loading量normalise了啊
02/25 19:54, 21F
推
03/02 19:17, , 22F
我同意 ele大的做法～ 做完 wb後用立春紅染一染看總蛋
03/02 19:17, 22F
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03/02 19:17, , 23F
白量
03/02 19:17, 23F
不好意思，實驗室目前沒有立春紅，但有需要的話會買。我想請問染立春紅後要如何定量 ? 如何呈色讓機器能夠偵測? 真的不太懂..謝謝 ※ 編輯: helen82323 (220.136.197.16), 03/07/2017 01:34:59
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03/07 20:22, , 24F
把最上面那串western看完再說
03/07 20:22, 24F
我跟隔壁實驗室借GAPDH來測試了，原本的actin真的不適合在我的sample當internal con trol，現在只能換internal全部打掉重來了，很多組sample都沒了要等老鼠，過去白白犧 牲了很可觀的時間跟老鼠，雖然很痛苦，但是找到問題癥結點真的是非常感謝各位的提點 。 ※ 編輯: helen82323 (223.140.105.217), 03/07/2017 23:58:02
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