[求救] 請問大腸桿菌表達蛋白問題
各位大大好，小弟最近進行大腸桿菌表達蛋白時出現了一個問題
實驗流程是這樣
沾取少量的菌加入10mL含有抗生素的LB
搖晃培養16小時後加入1L含有抗生素的LB
搖晃培養直到O.D值0.5~0.6之後加入1mM IPTG
表達4小時之後10000g離心收取菌
現在的問題在於:
離心收下來的菌異常的少，進而導致後續的純化結果很差
但是實驗流程明明有用UV測600nm波長的O.D值達到0.5~0.6之間
照理來說菌量應該取決於O.D值?
所以只要沒測錯就應該有正常的菌量才對
奇怪的是以前沒有這個問題，是自從改成1L的LB加入抗生素之後發現有這個狀況(以前沒加)
此外UV測量器是公用器材，似乎設定有被動過
小弟想知道的是
1.加入IPTG之後細菌是否會繼續生長
2.在大瓶1L的LB culture這邊加入抗生素是否影響後續細菌的生長
3.UV儀器小弟不熟，有設定能夠讓測的O.D值變得跟原先不同?
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抱歉小弟儀器沒有講清楚，這次主要在於與先前成功實驗的比較，所以不確定所謂正常的菌量該如何
我們實驗室比較偏化學，這部分的實驗沒有在看生長曲線，都是直接試，跑膠看哪個條件好
然後小弟有比較IPTG對細菌生長的影響，沒加IPTG細菌的OD值會比有加的高，表示有加的長比較不好?
小弟可能會再搖一個大量LB culture，來比較有無抗生素的影響
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老闆一直認為之前實驗條件得到的蛋白不夠濃不夠純，一直想改條件
討論後老闆認為大LB culture應該要加才對，先前的實驗是錯的，理由如qumai大所說
其實蠻合理的，但是菌真的變很少，所以現在要釐清到底是本來菌就不該長那麼多還是別的問題
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有找其他比較熟練的人去研究儀器，測量步驟沒錯，只是好像沒有甚麼標準品可以檢查儀器本身是否正常
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要做蛋白，大大說得很合理，也許其實本來就不該有這麼多菌?
小弟準備要純化長較少的菌跑膠看看
也許會比之前沒抗生素長較多菌的時候結果還要好
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誘導條件之前有抓過，應該還可以
抱歉我一直把問題放在菌量異常，沒有提到後面的實驗問題，我們是用his-tag搭配NTA beads純化
另外我們是先把10mL放到1L放大，測OD是測1L那瓶的OD值，10mL的就是養16小時沒有測OD
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10mL養在細長圓底瓶，沒有量OD，丟入1L裡面養到0.5-0.6大約3小時
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 03/22/2017 11:45:05
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