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[求救] 限制酶切不了

看板Biotech (生命科學)作者 (幫幫)時間8年前 (2017/07/11 17:22), 編輯推噓7(7推 0噓 32→)
留言39則, 10人參與, 最新討論串1/1
這是我所設計的primer F-primer 5'GCGGCCGCATGTGTCGGTACTTGAAG3' R-primer 5'GGATCCTTATCTTGGATGAGCGAC3' 使用的是NotI和BamHI 在重組的部分，已經有成功接上T vector,也送到DH5a裡面，經過PCR確認後也有目標基因 。但是之後想切下目標基因後，發現完全切不下來。 這是我用的條件 50uL plasmid +各1uL enzyme +2uL 3.1buffer 放4小時 50uL plasmid +各2uL enzyme +5uL 3.1buffer 放8小時 皆在37度 試過後發現都無法切下。 查過資料後，在想說會不會是DH5a跟NotI有甲基化的關係!?!?!也只是猜想而已。 請問各位，可以問問是我哪邊出問題嗎？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 42.76.130.67 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1499764939.A.BA0.html
推
07/11 17:46, , 1F
我是在想 你的primer前面怎麼沒有多幾個bp?
07/11 17:46, 1F
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07/11 17:47, , 2F
這樣能切嗎? 然後我去google T vector,查到pGEM-T
07/11 17:47, 2F
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07/11 17:47, , 3F
可是上面沒有BamHI阿...
07/11 17:47, 3F
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07/11 17:52, , 4F
單獨切試試?
07/11 17:52, 4F
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07/11 17:53, , 5F
然後定序，看一下enzyme site是不是正確
07/11 17:53, 5F
推
07/11 18:32, , 6F
NotI前面不加mer是切不下來的喔 (NEB說的)
07/11 18:32, 6F
推
07/11 18:40, , 7F
https://goo.gl/JadSUX 這裡有參考表格
07/11 18:40, 7F
推
07/11 18:42, , 8F
啊我目小沒看到TA cloning
07/11 18:42, 8F
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07/11 18:44, , 9F
推定序，另外確認下你的酵素是不是 HF 版本的
07/11 18:44, 9F
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07/11 18:52, , 10F
試試用TA附的F&R primer p出來再切然後接到你的載體吧
07/11 18:52, 10F
推
07/11 19:04, , 11F
兩個都沒切嗎?還有沒有supercoil的plasmid?
07/11 19:04, 11F
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07/11 19:08, , 12F
看到3.1buffer的用法,會讓人覺得整組實驗有問題
07/11 19:08, 12F
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07/11 20:53, , 13F
欸等等！？你不是把總體積補到 50？是直接下50 uL 的
07/11 20:53, 13F
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07/11 20:53, , 14F
plasmid 下去？
07/11 20:53, 14F
推
07/11 21:25, , 15F
2ul會不會太多@@
07/11 21:25, 15F
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07/11 21:25, , 16F
enzyme
07/11 21:25, 16F
推
07/11 21:54, , 17F
但咧，你那個buffer體積怎麼...不是1/10?
07/11 21:54, 17F
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07/12 00:04, , 18F
blence 我是用NEB double digest finder 去查他倆的最
07/12 00:04, 18F
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07/12 00:04, , 19F
佳buffer的，還是要用哪個比較妥當嗎？
07/12 00:04, 19F
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07/12 00:06, , 20F
xxtomnyxx 因為想要大量切膠回收，所以就把抽到的質體
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07/12 00:06, , 21F
直接全切下去，我第二組條件就有把buffer用1/10的比例
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07/12 00:06, , 22F
下去了
07/12 00:06, 22F
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07/12 00:12, , 23F
今天有嘗試分別切切看了，決定先放overnight看看
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07/12 00:17, , 24F
ampicillin 想問一下，因為是初次接觸重組基因這塊，
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07/12 00:17, , 25F
當初在設計primer，我其實還未了解限制酶前面要多加mer
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07/12 00:17, , 26F
這觀念，因為看之前學長都沒有加而且有順利切下，所以
07/12 00:17, 26F
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07/12 00:17, , 27F
覺得沒有影響。那請問是因為有Tvector的關係所以才不
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07/12 00:17, , 28F
用額外加其他mer嗎？
07/12 00:17, 28F
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07/12 00:19, , 29F
第二次,如果50ul是plasmid體積量,那還是不符合1/10
07/12 00:19, 29F
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07/12 00:21, , 30F
第一次的digest如果不是錯字,基本上不該出現這的做法的
07/12 00:21, 30F
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07/12 00:24, , 31F
會採用不符合1/10的操作,暗示整個cloning過程會有未知錯誤
07/12 00:24, 31F
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07/12 00:25, , 32F
RE site後面多加mer的部分,因為你用TA,這不需要煩惱
07/12 00:25, 32F
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07/12 00:28, , 33F
反而是為了配合TA而用Taq時,未訂序直接往後做怕會有mutant
07/12 00:28, 33F
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07/12 00:29, , 34F
還有就是老問題了,文中標示總量或濃度比較能看出問題,
07/12 00:29, 34F
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07/12 00:31, , 35F
而不是體積;另外cloning的試劑,有廠牌訊息也方便辨識
07/12 00:31, 35F
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07/12 00:33, , 36F
還有><,你查到的NotI只對CpG敏感,用DH5a完全不用擔心這個
07/12 00:33, 36F
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07/12 07:34, , 37F
其實切得動的話，放1小時就會切了，不需要到O/N，尤其你又只
07/12 07:34, 37F
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07/12 07:34, , 38F
是要測試而已
07/12 07:34, 38F
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07/12 23:52, , 39F
有沒有測濃度啊?會不會太濃了然後buffer量又不對?
07/12 23:52, 39F
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