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[求救] gDNA digest後的條帶與如何標定marker

看板Biotech (生命科學)作者 (葉綠體)時間7年前 (2018/03/27 11:02), 7年前編輯推噓0(0推 0噓 12→)
留言12則, 3人參與, 7年前最新討論串1/1
大家好!我又來請教問題了。 最近一直在做southern blot,每次做完digestion跑膠後看到的膠圖看到smearing 條帶是 正常的，但做了幾次發現每次digestion幾乎每個sample在特定幾個位置上都有明顯的條 帶出現，如下圖 https://i.imgur.com/L0AfHvk.jpg
想問這些明顯的條帶是什麼?謝謝! 註: 1. EcoRI, BamHI, XbaI都有 2. 15 ug DNA做digestion 3. 材料來源是番茄 4. marker為100bp marker ------------------------------------------- 另一個問題是如何標定marker，先前學長用的是genemark很舊的kb marker， 不知道什麼原因可以讓probe hy上去並且在底片顯示出來，但後來新出的marker無法。 昨天boss要求marker也要跑出來方便看條帶大小。 想問有人了解如何設計a-32p標定的probe定位marker，方法是否方便告知，謝謝! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 39.8.32.60 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1522119756.A.18C.html
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03/27 11:15, 7年前 , 1F
restriction endonuclease跟一般endonuclease的差別
03/27 11:15, 1F
謝謝B大，這個我了解。但是經過切割後在特定位置出現數個明顯的大片段條帶， 讓人很好奇那個區域究竟是什麼? 剛才查到https://goo.gl/GkVNg6 內文說:"In contrast, genomic DNA from bacterial genomes is millions of base pairs long, while genomic DNA from eukaryotic chromosomes may be tens of millions to hundreds of millions of base pairs. Consequently, digests of genomic DNA yeild thousands of bands, which can not be resolved individually . Hence, a genomic digest looks like a continuous smear, as shown below. The one exception is high-copy number repetitive sequences which show bands because each copy has the same restriction sites (arrows)" 所以我的膠圖顯示的條帶是重複性序列嗎? 如果是，這又讓我困惑重複性序列區間長度可能高達3kb,8kb甚至14kb以上嗎? 這區間難道都沒有recognize cutting site嗎? 以上疑問懇請解惑，謝謝! ※ 編輯: fishg1216 (140.120.190.245), 03/27/2018 12:02:41
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03/27 17:05, 7年前 , 2F
重複性序列絕對可以那麼大沒問題
03/27 17:05, 2F
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03/28 00:49, 7年前 , 3F
謝謝l大!!
03/28 00:49, 3F
※ 編輯: fishg1216 (140.120.190.245), 03/28/2018 10:02:16
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03/28 11:12, 7年前 , 4F
a-32p的話,DNA ladder可用Klenow Fragment去label
03/28 11:12, 4F
謝謝b大，可否再詳細說明呢? 目前我的probe製作是 1. 70 ng DNA補水至總體積10 ul 2. 100度乾浴變性 7分鐘 3. 加入11 ul LS，1 ul klenow (3U) 4. 加5 ul a-32P 5. 37度乾浴反應 2小時 但我不清楚DNA ladder各家廠牌是否都適用b大你說的方法? ps.我們實驗室 DNA ladder是用 genemark 想請教ladder probe製作的詳細方法。 製作完後的DNA ladder probe是否可以和我的專ㄧ性probe同時加入去標定， 還是有先後順序之分? 最後，我目前固定用5 ul DNA ladder與sample一起跑， 想問這樣的用量在做southern blot時， 標定出來的ladder訊號是否會過強而掩蓋了我的sample訊號? 以上問題麻煩指教，感謝! ※ 編輯: fishg1216 (140.120.190.245), 03/28/2018 13:04:04 ※ 編輯: fishg1216 (140.120.190.245), 03/28/2018 13:28:02
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03/28 13:46, 7年前 , 5F
我說的是跑膠時就加32P-labeled DNA ladder，訊號太強就減
03/28 13:46, 5F
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03/28 13:47, 7年前 , 6F
量或用cold DNA ladder稀釋
03/28 13:47, 6F
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03/28 13:49, 7年前 , 7F
32P半衰期算快了,如果不鮮配,就只能每次調整比例用
03/28 13:49, 7F
抱歉，誤會你的意思了! 但跑膠時就加32p-labeled DNA ladder 在我們實驗室或者 放射線用的暗房都不可行，所以僅有這個方式可用嗎? 謝謝! ※ 編輯: fishg1216 (140.120.190.245), 03/28/2018 14:33:03
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03/28 16:35, 7年前 , 8F
end labeling有很多方式 p32最方便 不過也可以label
03/28 16:35, 8F
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03/28 16:35, 7年前 , 9F
像是biotin/dig再transfer後用strep/Ab接hrp像壓weste
03/28 16:35, 9F
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03/28 16:35, 7年前 , 10F
rn一樣偵測
03/28 16:35, 10F
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03/28 16:36, 7年前 , 11F
但是這沒什麼意義啊 底片放到membrane上描marker有什
03/28 16:36, 11F
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03/28 16:37, 7年前 , 12F
麼問題嗎? 大家western不是都這樣壓
03/28 16:37, 12F
謝謝I大回應，因為我的boss堅持要用label的方式呈現，否則我也想依照膠後marker 的相對位置將底片marker位置標出來，而不用這麼麻煩還去做probe標定ladder ※ 編輯: fishg1216 (140.120.190.245), 03/28/2018 19:56:45
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