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[求救] DNase處理後仍有gDNA

看板Biotech (生命科學)作者 (linpooh1029)時間7年前 (2018/04/25 10:09), 編輯推噓6(6推 0噓 26→)
留言32則, 6人參與, 7年前最新討論串1/1
目前用exiqon RNA isolation kit, 照上面建議的protocol DNase(biolab) 0.375U/uL，25 -30度反應20分鐘，和37度10分鐘(biolab建議),出來的gel還是有gDNA。 想問是還要拉長時間還是濃度增加?我是要for miRNA，抽了好幾匹組織還是有gDNA污染，想 請大家幫幫忙。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 42.72.190.149 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1524622153.A.5A8.html
推
04/25 10:30, 7年前 , 1F
DNase用多了會影響RNA品質,可以考量下游的試驗需要多純的
04/25 10:30, 1F
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04/25 10:30, 7年前 , 2F
RNA再決定如何處理
04/25 10:30, 2F
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04/25 14:14, 7年前 , 3F
抽 RNA 有 gDNA 參雜其實很常見，主要是看你後續的實驗
04/25 14:14, 3F
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04/25 14:14, 7年前 , 4F
會不會被 gDNA 干擾，不會的話就可以不理它
04/25 14:14, 4F
推
04/25 14:16, 7年前 , 5F
gDNA很難完全去除,所以control會一大堆
04/25 14:16, 5F
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04/25 14:16, 7年前 , 6F
主要原因之一就是排除gDNA的訊號
04/25 14:16, 6F
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04/25 15:25, 7年前 , 7F
我是用在miRNA qpcr, primer 設計辨認poly A,但我們
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04/25 15:25, 7年前 , 8F
是認為g DNA上也會有會影響到
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04/25 17:47, 7年前 , 9F
@lingon 我出來的DNA量在gel都是多於RNA的QQ
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04/25 18:53, 7年前 , 10F
miRNA qPRC primer 怎麼會設計在 polyA 上？
04/25 18:53, 10F
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04/25 19:03, 7年前 , 11F
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04/25 19:03, 7年前 , 12F
我們miRNA也是用kit的
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推
04/25 19:04, 7年前 , 13F
同樓上問題
04/25 19:04, 13F
推
04/25 19:06, 7年前 , 14F
polyA感覺是自己加上去的
04/25 19:06, 14F
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04/25 20:31, 7年前 , 15F
嗯，你放那張圖不妥，省略掉 polyA polymerase 的處理
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04/25 20:31, 7年前 , 16F
會讓人困惑。
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04/25 20:37, 7年前 , 17F
從這個實驗的原理看來 gDNA 理論上不會有影響。你要是
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04/25 20:37, 7年前 , 18F
真的擔心會有影響，就做幾次拿少量你抽的 RNA 用 RNase
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04/25 20:37, 7年前 , 19F
A 處理過再做一樣的 polyadenylation、RT 和 qPCR。
04/25 20:37, 19F
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04/25 20:37, 7年前 , 20F
測不到訊號就表示不會有影響。
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04/25 20:39, 7年前 , 21F
另外，column 抽 RNA 真的要抽得很爛才會 gDNA 比 RNA
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04/25 20:39, 7年前 , 22F
多，一般這都是表示你 sample over loading 了
04/25 20:39, 22F
推
04/25 21:45, 7年前 , 23F
看你的樣本吧..如果是非模式物種真的甚麼怪事都會有的
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04/25 21:46, 7年前 , 24F
我以前玩LNA miRNA qPCR的DNase是用別的牌子做的
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04/25 21:47, 7年前 , 25F
吃不乾淨我們會再吃一趟，通常兩趟會乾淨的
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04/25 21:59, 7年前 , 26F
這圖是kit附的哈哈， 他是後來加上polya沒錯，但就
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04/25 21:59, 7年前 , 27F
是怕那段reverse primer會跑到gdna，不知道前輩們覺
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04/25 21:59, 7年前 , 28F
得有沒有可能QQ
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04/25 22:01, 7年前 , 29F
我是抽mice embryo 現在是拿embryo不要的部位測試ki
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04/25 22:01, 7年前 , 30F
t。
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04/25 22:01, 7年前 , 31F
謝謝各位大大的幫忙QQ
04/25 22:01, 31F
推
05/29 22:27, 7年前 , 32F
Biorad好像有kit可以解決，業務推過，問問應該有
05/29 22:27, 32F
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