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[求救] 關於16s rDNA的qPCR問題

看板Biotech (生命科學)作者 (帽子)時間5年前 (2019/03/10 13:01), 5年前編輯推噓5(5推 0噓 13→)
留言18則, 5人參與, 5年前最新討論串1/1
目前是研究生 老闆要我做不同採樣方法得到的菌量差異 但本身對分生方面很陌生 他的意思是採樣完後抽dna跑qPCR （我是參考paper上使用16s rRNA primer去夾） 看Ct值去比較菌量多寡 我一直覺得這方法有很多疑點 (姑且先不論dna的萃取效率) 但是老闆卻叫我照他說的做就對了 身邊也沒有專人能提點 所以想想請問板上的專家 這樣是真的可行的嗎 後來是有開始做qPCR的實驗 (使用sybr的mixer) 結果發現連作為blank的水Ct值都有30左右 因為採樣的菌量相當之少 我的樣品則在26之間浮動 使用的水有過0.22膜也滅過菌了 耗材也是用完就丟 想請問是環境污染所致嗎 也有考慮到mixer本身就有dna的殘留問題 想請問有沒有能夠改善的方法 感謝各位撥冗閱讀 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.235.45 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1552194106.A.439.html
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03/10 14:11, 5年前 , 1F
好奇想知道你對於qPCR用來推測菌量的疑點是什麼？
03/10 14:11, 1F
因為之前有看到好像不同細菌他們的16s rRNA copy數目不同，這樣是不是會有誤差呢? 另外是不是使用某種菌做標準曲線求總菌數的意義也不大了這樣 還有因為是做相對定量，請教一下reference gene要如何選擇呢?謝謝 ※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/10/2019 16:08:25 ※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/10/2019 22:17:54 ※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/10/2019 22:18:36
推
03/10 22:59, 5年前 , 2F
水控制的那組melting curve 跟 amplify curve 先看有沒
03/10 22:59, 2F
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03/10 22:59, 5年前 , 3F
有線，可以知道是不是真的有16s片段在裡面或是雜訊
03/10 22:59, 3F
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03/10 23:00, 5年前 , 4F
同一批操作DNA萃取萃取效率應該要差不多的，除非你樣本
03/10 23:00, 4F
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03/10 23:00, 5年前 , 5F
條件差很多
03/10 23:00, 5F
推
03/10 23:02, 5年前 , 6F
16s rDNA定量菌數的文章滿多的了方法應該是確立的
03/10 23:02, 6F
水的話amplify curve是有線的，melting curve比較奇怪一點，我做三重複，但每組裡面都會有一個出現兩個峰，另外三重複的CT值很不穩定，常常在35-29之間跳，我每次都有做一組E coli當作positive control，他的melting curve和Ct值都很穩定，所以現在不太清楚到底是污染還是我操作手法有問題，另外我查資料似乎都是使用16s rRNA作為control去定某個特定菌的菌量，關於這部分我可能還要再找找，謝謝A大
推
03/11 16:53, 5年前 , 7F
經驗中 水有訊號通常是污染
03/11 16:53, 7F
推
03/11 16:56, 5年前 , 8F
你的疑慮的確有重要性 但是以實用性考量現在還是以qPC
03/11 16:56, 8F
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03/11 16:56, 5年前 , 9F
R為主流 畢竟沒人有錢到什麼都打sequencing
03/11 16:56, 9F
後來有用分子生物等級的水做過，一樣是有訊號的QQ 所以照I大的意思是還是可以用Ct值去判斷採樣手法菌量的多寡嗎?謝謝! ※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/11/2019 20:57:22 ※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/11/2019 20:58:34
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03/12 10:56, 5年前 , 10F
我之前也有用這個方法測菌量sample的melting curve 通
03/12 10:56, 10F
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03/12 10:56, 5年前 , 11F
常是同一個peak有多個表示污染了
03/12 10:56, 11F
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03/12 10:56, 5年前 , 12F
然後純水訊號應該沒有或是微弱(Ct很大)http://i.imgur.
03/12 10:56, 12F
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03/12 10:56, 5年前 , 13F
com/0YJwnMt.jpg
03/12 10:56, 13F
回F大，所以純水會有Ct是必然的囉?我後來試了很多組primer，有些melting curve的peak就是會有很多個，如圖https://imgur.com/GzB2ziN
，不知道是不是dimer的生成還是汙染之類的，謝謝你的回答!
推
03/13 19:09, 5年前 , 14F
回原po 對 Ct是ok的 然後樓上+1 通常水有訊號都是自己
03/13 19:09, 14F
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03/13 19:09, 5年前 , 15F
手殘cross contaminate到
03/13 19:09, 15F
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03/13 19:10, 5年前 , 16F
然後不只要看peak還要看強度 有時候只是noise
03/13 19:10, 16F
回I大，像這圖https://imgur.com/jjr6ePl
綠色是水，藍色是E coli，其實peak差不多強，可能真的是我手法的問題吧QQ，謝謝!
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03/15 00:12, 5年前 , 17F
是否有試過別的廠牌的mastermix? 或許可要一些試用品
03/15 00:12, 17F
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03/15 00:12, 5年前 , 18F
看看
03/15 00:12, 18F
回m大，有喔，試了4 5 家的試劑了，P水都會有訊號 ※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/21/2019 13:58:29 ※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/21/2019 13:59:46 在這裡回覆一下，後來有看到幾篇paper，都有提到關於qPCR reagent污染的問題，所以用16s rRNA universal primer p水出現Ct值可能真的是無法避免的，後來我有再試了幾組primer，找到了melting curve出來peak比較乾淨的primer了，沒意外的話應該就會繼續做下去了，謝謝版上各位前輩提供的經驗! ※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/21/2019 14:06:50 ※ 編輯: Cappello (140.112.98.220), 03/21/2019 14:07:40
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